王 帥，賈琦珍，陳根元，張 玲，馬春暉,3*(1.塔里木大學 動物科學學院，新疆 阿拉爾843300；.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾843300；3.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子83000)

不同生長時期小花棘豆總黃酮含量及其抗氧化活性研究

王 帥1,2，賈琦珍2，陳根元2，張 玲1,2，馬春暉2,3*
(1.塔里木大學 動物科學學院，新疆 阿拉爾843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾843300；3.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子832000)

研究不同生長時期小花棘豆總黃酮含量的變化及其與清除自由基能力的關(guān)系。試驗選用6個生長時期的小花棘豆作為檢測樣本，利用甲醇超聲波提取總黃酮，并采用硝酸鋁顯色法測定小花棘豆總黃酮含量，然后通過分析黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除作用，評價其抗氧化能力。結(jié)果表明，不同生長時期小花棘豆黃酮含量及自由基清除能力存在著顯著差異(P<0.05)，結(jié)莢期小花棘豆總黃酮含量和自由基清除能力均高于其它生長期(P<0.05)，小花棘豆黃酮含量與DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力均存在極顯著的正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.950、0.933和0.972。

小花棘豆；黃酮；自由基；動態(tài)變化

小花棘豆(Oxytropis glabra DC)是豆科棘豆屬植物，在新疆分布廣泛，是本區(qū)草原主要的有毒植物之一，放牧家畜采食小花棘豆后極易發(fā)生中毒[1]。自20世紀70年代以來，由于小花棘豆不斷地生長蔓延，使牧場草群結(jié)構(gòu)劣變，草地生態(tài)惡化，嚴重威脅著草地畜牧業(yè)的發(fā)展。但目前研究表明，小花棘豆含有較為豐富的活性物質(zhì)，據(jù)蒙藥典記載，小花棘豆能夠治療關(guān)節(jié)炎、牙痛、神經(jīng)衰弱等，有麻醉、鎮(zhèn)靜、止痛等功效。黃酮類化合物是小花棘豆的活性成分之一。于榮敏等[2,3]從小花棘豆地上部分中分離得到了2種黃酮醇、3種黃酮醇甙和1種黃酮甙；羅揚[4]對內(nèi)蒙古小花棘豆黃酮類物質(zhì)的含量進行了測定；王帥等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆黃酮具有較好的抗脂質(zhì)氧化作用，有作為天然抗氧化劑開發(fā)的價值。目前，有關(guān)小花棘豆的抗氧化成分分析及不同生長時期小花棘豆抗氧化能力的變化趨勢尚未見詳細報道。本試驗擬通過比較小花棘豆不同生長時期總黃酮含量，采用DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基分析法測定其清除自由基的能力，研究評價小花棘豆黃酮與自由基清除能力之間的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小花棘豆采集于新疆阿拉爾市托喀依鄉(xiāng)，由塔里木大學動物科學學院草業(yè)科學學科組鑒定。根據(jù)物候期觀察，小花棘豆在阿拉爾的出苗期為5月下旬，分枝期為6月中下旬，現(xiàn)蕾期為7月上旬，盛花期為7月下旬，結(jié)莢期為8月中旬，落葉期為10月上旬。在各時間段內(nèi)采集不同生長時期的小花棘豆地上部分，陰干，粉碎，過20目篩后備用。

1.2 試劑與儀器

2,2-二苯基-1-苦肼基自由基(DPPH)，德國Sigma；蘆丁標準品，國藥集團化學試劑有限公司；維生素C(VC)，天津市光復精細化工研究所；甲醇、氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。 Carry 100型紫外-可見分光光度計，美國Varian； BS124型精密電子天平，德國Sartorius；Direct-Q3型超純水系統(tǒng)，美國Millipore；KQ-400DB型醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 小花棘豆黃酮的提取

試驗參考王帥等[7]的小花棘豆黃酮提取方法。精密稱取小花棘豆樣品10.00 g，加φ=100%甲醇50 mL，超聲浸提 45 min，超聲波功率 800 w，溫度 45 ℃。過濾后殘渣再加φ=100%甲醇50 mL浸提 1次，合并濾液，用φ=100%甲醇定容至100 mL，4℃避光保藏，備用。

1.4 小花棘豆黃酮的測定

精密稱取蘆丁對照品10.0 mg，用φ=100%甲醇溶解，完全移入100 mL容量瓶中，加φ=100%甲醇定容至刻度，搖勻即得濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。

準確吸取蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加φ=100%甲醇補至10 mL，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色方法操作，以溶液1為空白，在274 nm波長處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程A=0.01844C+0.00481，R2=0.9997，表明樣品檢測濃度在0～32 mg/L的范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

準確吸取待測樣品溶液1.0 mL，平行3份，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色方法操作，測定吸光度，計算黃酮類物質(zhì)含量。

1.5 小花棘豆黃酮體外抗氧化活性的測定

以VC作為陽性對照，按王燕等[8]的方法測定不同生長時期小花棘豆黃酮對DPPH自由基的清除率。并根據(jù)樣品對DPPH清除作用曲線計算得到DPPH自由基的起始濃度減少至50%時樣品的添加量(IC50)。按蒙秋霞等[9]的研究，以φ=55%乙醇為空白對照，采用鄰苯三酚自氧化法測定樣品及對照品的超氧陰離子自由基清除率。參照Bosetti等[10]的研究，以改進的水楊酸法測定其清除羥基自由基的能力。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS 16.0中One-Way ANOVA進行單因素方差分析，差異顯著時采用LSD法進行多重比較，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示，并進行簡單相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長時期小花棘豆黃酮含量

由表1可知，在不同生長時期中，小花棘豆黃酮含量存在著較大的差異。其中結(jié)莢期小花棘豆黃酮含量最高，各生長時期小花棘豆黃酮含量依次為：結(jié)莢期﹥現(xiàn)蕾期﹥出苗期﹥盛花期﹥分枝期﹥落葉期。結(jié)莢期小花棘豆黃酮含量顯著高于出苗期、盛花期和分枝期(P<0.05)，極顯著高于落葉期(P<0.01)。

表1 不同生長時期小花棘豆的黃酮含量Table 1 Content of total flavonoid of O.glabra DC in different harvesting periods mg/g

注：同行肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Notes:Values with different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05),and the capital letter superscripts mean highly significant difference (P<0.01).The same as below.

2.2 不同生長時期小花棘豆黃酮清除DPPH自由基能力的測定

由圖1可知，不同生長時期小花棘豆黃酮清除DPPH自由基的能力存在顯著差異。其中結(jié)莢期和現(xiàn)蕾期小花棘豆黃酮對DPPH自由基均具有較好的清除效果，其IC50值分別為15.48 mg/L和16.06 mg/L，極顯著低于VC的28.80 mg/L(P<0.01)；出苗期、盛花期和分枝期IC50值分別為25.96 mg/L、30.12 mg/L和33.54 mg/L，與VC差異不顯著(P>0.05)；落葉期IC50值為106.84 mg/L，極顯著高于VC和其它生長期小花棘豆黃酮(P<0.01)。表明小花棘豆黃酮對DPPH自由基具有較好的清除效果，結(jié)莢期和現(xiàn)蕾期小花棘豆黃酮對DPPH自由基的清除效果均優(yōu)于VC。

2.3 不同生長時期小花棘豆黃酮清除超氧陰離子自由基能力的測定

小花棘豆黃酮對超氧陰離子自由基的清除結(jié)果表明，不同生長時期小花棘豆黃酮樣品的濃度與超氧陰離子的清除率均呈現(xiàn)一定量的正相關(guān)關(guān)系。其原因可能為黃酮類物質(zhì)降低了反應體系中O2-自由基濃度，從而加速了鄰苯三酚自氧化反應的進行。由圖2可知，結(jié)莢期和現(xiàn)蕾期小花棘豆黃酮各濃度清除超氧陰離子自由基的效果均好于VC對照；出苗期、盛花期和分枝期小花棘豆黃酮濃度較低時清除率高于VC，但濃度較高時低于VC；落葉期小花棘豆黃酮清除超氧陰離子自由基的效果最差。

圖1 小花棘豆黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.1 Effects of the tlevowoid of O.plabra DC on the DPPH free radical

圖2 小花棘豆黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of sample and control on superoxide anion

2.4 不同生長時期小花棘豆黃酮清除羥基陰離子自由基能力的測定

由圖3可知，隨著小花棘豆黃酮濃度的增加，其清除羥基自由基的活性也隨之增加，黃酮質(zhì)量濃度與羥基自由基清除率呈量效的正相關(guān)關(guān)系。結(jié)莢期、現(xiàn)蕾期、出苗期、盛花期和分枝期小花棘豆黃酮清除羥基自由基的效果均好于VC。

圖3 小花棘豆黃酮對羥基陰離子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of sample and control on hydroxide free radical

2.5 小花棘豆黃酮與自由基清除能力的相關(guān)性

以DPPH自由基清除率(y)為因變量，小花棘豆黃酮含量(x)為自變量進行相關(guān)回歸分析，得到方程y=0.196x+18.476，相關(guān)系數(shù)為0.950；以超氧陰離子自由基清除率(y)為因變量，小花棘豆黃酮含量(x)為自變量進行相關(guān)回歸分析，得到方程y=0.183x+16.81，相關(guān)系數(shù)為0.933；以羥基自由基清除率(y)為因變量，小花棘豆黃酮含量(x)為自變量進行相關(guān)回歸分析，得到方程y=0.174x+17.331，相關(guān)系數(shù)為0.972?？梢?，小花棘豆黃酮含量與DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力均存在極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，表明黃酮類物質(zhì)是小花棘豆清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的主要功效成分。

3 討 論

黃酮類化合物是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，其含量的動態(tài)變化與植物體生長發(fā)育密切相關(guān)，并且受到溫度、光照、土壤等生長環(huán)境的影響。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)莢期小花棘豆黃酮含量最高，各生長時期小花棘豆黃酮含量依次為：結(jié)莢期﹥現(xiàn)蕾期﹥出苗期﹥盛花期﹥分枝期﹥落葉期。羅揚[4]以內(nèi)蒙古鄂爾多斯小花棘豆為研究對象，發(fā)現(xiàn)8月份小花棘豆總黃酮含量最低，9月份含量最高；各月份的黃酮含量依次為：9月份>5月份>6月份>7月份>8月份，與本試驗研究結(jié)果差異顯著。其原因可能為小花棘豆生長環(huán)境的不同所致。Carvalho等[11]研究發(fā)現(xiàn)長日照能誘導大量類黃酮途徑相關(guān)基因的表達，從而顯著增加植物葉片中的黃酮醇含量。南疆地區(qū)小花棘豆自5月下旬出苗后，葉片不斷發(fā)育，光合作用不斷加強，合成黃酮類物質(zhì)的原料不斷增加，再加上日照時間的延長誘導類黃酮途徑相關(guān)基因的表達，引起小花棘豆總黃酮含量的提高。分枝期和盛花期小花棘豆黃酮含量低于出苗期，其原因可能為分枝期為小花棘豆器官大量分化形成期，光合產(chǎn)物向其他產(chǎn)物的迅速轉(zhuǎn)化導致光合產(chǎn)物總積累量不夠，因而向黃酮類化合物的轉(zhuǎn)化相對不夠；盛花期植物需要較多營養(yǎng)物質(zhì)供給開花，可能使小花棘豆次生代謝產(chǎn)物合成量降低。另外，南疆地區(qū)5月以后沙塵天氣較多，也可能造成小花棘豆光合作用下降，導致其黃酮含量降低。DPPH 是一類較為穩(wěn)定的自由基，天然抗氧化物清除 DPPH 自由基的能力在某種程度上可以反映其抗氧化清除自由基的總能力；超氧陰離子自由基是氧氣在生物體內(nèi)形成的第一個自由基，不僅自身具有毒性，而且可以經(jīng)過一系列反應生成其它氧離子自由基，進一步對生物產(chǎn)生損害；羥基自由基可破壞生物的細胞膜，降解DNA，對生物機體危害極大。本試驗結(jié)果表明，小花棘豆黃酮提取液對不同自由基的清除能力均較強，其中結(jié)莢期和現(xiàn)蕾期小花棘豆黃酮清除自由基的能力均強于VC對照，表明這兩個生長時期的小花棘豆在抗氧化方面具有很大的潛能。不同生長時期小花棘豆黃酮含量差異顯著，相關(guān)性分析表明，小花棘豆黃酮含量與DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基清除率均呈顯著正相關(guān)。小花棘豆黃酮含量與其抗氧化能力是完全的線性變化關(guān)系，與張艷軍等[12]的報道一致。另外，于榮敏等[2,3]研究表明，小花棘豆中黃酮類成分主要以黃酮苷的形式存在，苷元包括芹菜素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白楊素、鼠李素、異鼠李素、甲基鼠李素、鼠李檸檬素等。不同生長時期的小花棘豆黃酮含量差異顯著，其組成可能也有較大差異。而不同種類、不同結(jié)構(gòu)的黃酮化合物具有不同的抗氧化功效，因此對于不同生長時期小花棘豆黃酮抗氧化活性的研究也更有意義。

根據(jù)劉璐等[13]的研究，小花棘豆地上部分黃酮類物質(zhì)含量顯著高于急彎棘豆、黃花棘豆和冰川棘豆，表明小花棘豆在黃酮類化合物的提取和利用方面具有巨大的開發(fā)價值，值得進一步研究和探索。

4 結(jié) 論

小花棘豆含有較多的黃酮類物質(zhì)，其不同生長時期總黃酮含量的高低順序依次是：結(jié)莢期>現(xiàn)蕾期>出苗期>盛花期>分枝期>落葉期。小花棘豆黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基均具有較強的清除作用，相關(guān)性分析表明小花棘豆黃酮含量與自由基清除率具有極顯著的正相關(guān)，其中羥基自由基清除能力與小花棘豆黃酮含量的相關(guān)性最強。結(jié)莢期和現(xiàn)蕾期小花棘豆黃酮清除自由基的能力均強于VC對照。

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TotalFlavonoidsofOxytropisglabraDCatDifferentGrowthPhasesandtheirAnti-oxidativeAbility

WANG Shuai1,2,JIA Qi-zhen2,CHEN Gen-yuan2,ZHANG Ling1,2,MA Chun-hui2,3*

(1.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,Xinjiang843300,China;2.KeylaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300,China;3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832000,China)

In the present study,the change of total flavonoids content and antioxidant activity of Oxytropis glabra DC during growth were measured,and the relationship between them was also investigated.O.glabra DC samples were collected in 6 different growth periods,and total flavonoids of O.glabra DC were extracted with methanol by ultrasound-assisted method,the contents of total flavonoids in different growth periods in O.glabra DC were measured using the aluminum nitrate spectrophotometric method,and the antioxidant abilities were estimated by DPPH free radical,superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activity.The results showed that total flavonoids content and free radical scavenging activity in O.glabra DC were significantly different throughout growth phases,the sample picked in pod-setting stage had the highest content of total flavonoids and free radical scavenging activity.There were very significant positive relationship between flavonoid content and DPPH free radical,superoxide anion and hydroxyl radical scavenging capacity,with the correlation coefficients being 0.950,0.933 and 0.972.O.glabra DC in pod-setting stage had the highest content of flavonoid,which suggests that O.glabra DC can be considered as a valuable source of antioxidant products.

oxytropis glabra DC; flavonoid; free radical; dynamics

2014-04-12，

2014-05-04

“十二五”國家科技支撐計劃子項目(2011BAD17B05);新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS201402)

王 帥(1984-)，男，山西長治人，碩士，實驗師，主要從事牧草資源開發(fā)利用方面的研究。 E-mail:wangshuaidky@126.com

*[通訊作者] 馬春暉(1966-)，男，新疆哈密人，博士，教授，博士生導師，主要從事牧草生產(chǎn)與牧草加工方面的研究。 E-mail:chunhuima@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0061-05