唐云濤，粟桂蓉，謝 毓，易浪波

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000)

基于PsbA-trnH，RbcL和trnL-F序列的野生葡萄系統(tǒng)發(fā)育*

唐云濤1,2，粟桂蓉1,2，謝 毓1,2，易浪波1,2

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000)

采用PCR技術(shù)從湘西地區(qū)的3種野生葡萄中分離PsbA-trnH、RbcL和trnL-F基因片段，克隆至pMD18-T載體中測序，結(jié)合GenBank/EMBL/DDBJ中公布的其他葡萄科植物相應(yīng)cpDNA基因信息，使用Mega4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.結(jié)果顯示，PsbA-trnH，RbcL和trnL-F這3種cpDNA基因序列均能用于葡萄科屬間的分子鑒定，但結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類存在一些差異，RbcL能用于葡萄屬內(nèi)種間的分子鑒定.

野生葡萄；PsbA-trnH；RbcL；trnL-F；系統(tǒng)發(fā)育

葡萄科(Vitaceae)由16個屬和770多個種構(gòu)成，主要分布在亞洲、非洲、澳大利亞和太平洋群島等熱帶和溫帶地區(qū).葡萄科在真雙子葉植物中系統(tǒng)發(fā)育位置存在著不少爭議，該科一些種屬系統(tǒng)分類地位不明確，科間、科內(nèi)甚至有些屬間歸屬還存在混亂現(xiàn)象，如關(guān)于火筒樹屬(leea)有不少研究認(rèn)為應(yīng)歸屬于火筒樹科(Leeaceae)[1-2].葡萄屬(Vitis)作為該科中典型屬之一，主要分布在東亞、北美以及歐洲至中亞[1].葡萄屬多樣性以東亞最高，北美次之，歐洲至中亞品種較少.全葡萄科中，葡萄屬比較特殊，除了東亞分化的許多種外，美國中部、南部和東部也有特殊的種[3-4].中國是葡萄屬植物原產(chǎn)國之一，已發(fā)現(xiàn)的葡萄種或變種多達(dá)50余個，并且還不斷有新種報道.目前葡萄屬系統(tǒng)分類也一直存在不少問題[2,4].

基于分子技術(shù)的植物分類學(xué)研究是近些年興起的新型系統(tǒng)分類學(xué)方法，它可以有效解決形態(tài)學(xué)上比較復(fù)雜的分類事件.葉綠體DNA(chloroplast DNA，cpDNA)是存在于植物葉綠體中的基因組DNA，其編碼的基因數(shù)量、組成和排列在不同物種間基本一致，具有進(jìn)化上的保守性，因此cpDNA經(jīng)常用于研究科屬種以上的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[1,5-6].湘西位于湖南省西北部，擁有豐富的亞熱帶植物資源，其境內(nèi)有葡萄屬植物17種和1個亞種，但目前有關(guān)其分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究未見報道.筆者擬采用PCR技術(shù)從湘西地區(qū)3種野生葡萄中分離PsbA-trnH，RbcL，trnL-F基因片段，進(jìn)行克隆和測序，并結(jié)合GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已公布的葡萄科其他屬種的3種相應(yīng)cpDNA基因序列進(jìn)行屬間以及種間系統(tǒng)分類學(xué)研究，以期驗(yàn)證PsbA-trnH，RbcL，trnL-F這3種cpDNA基因序列運(yùn)用于葡萄屬種間親緣關(guān)系系統(tǒng)分類學(xué)研究的可行性，為湘西地區(qū)葡萄屬植物的系統(tǒng)分類研究提供分子水平證據(jù)，并為該地區(qū)葡萄屬植物資源的保護(hù)與利用提供參考數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)材料采集于湘西地區(qū)的八面山、天門山和德夯景區(qū)(見表1)，分別為毛葡萄(VitisquinquangularisRehd.)、刺葡萄(VitisdavidiiFoex.)和華南美麗葡萄(VitisbellulaRehd.).所有樣品采集后于-70 ℃低溫保存?zhèn)溆?

pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶和DNA片段純化試劑盒及其相關(guān)分子生物學(xué)試劑購自大連TakaRa公司，其他生化試劑購自生工生物工程(上海)有限公司.

表1 3種野生葡萄采樣信息及其cpDNA基因片段的序列登錄號

1.2方法

1.2.1 野生葡萄中基因組DNA的提取 分別稱取1 g野生葡萄幼嫩葉片，在液氮中研磨成粉末，采用改進(jìn)的CTAB法[7]提取其基因組DNA，即將研磨成粉末的樣品置于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%PVP和2%β-巰基乙醇的CTAB抽提液中60 ℃孵育1 h，然后用V氯仿∶V異戊醇=24∶1抽提2次，用0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA，最后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌1次，得到的DNA溶解于50 μL TE buffer(pH值為8.0)中.

1.2.2 野生葡萄cpDNA基因片段的PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中公布的PsbA-trnH，RbcL和trnL-F這3種cpDNA基因序列數(shù)據(jù)，利用軟件Primer 5設(shè)計(jì)3對保守引物.引物序列分別為：PsbA-trnH，上游5’-GTTATGCATGAACG TAATGCTC-3’，下游5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATC-3’；RbcL，上游5’-ATGTCACCAC AAACGGA-3’，下游5’-TCAAATTCAAACTTGATTTCTTTCCA-3’;trnL-F，上游5’-CGAAAT CGGTAGACGCTACG-3’，下游5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’.引物由生工生物工程(上海)有限公司合成.

PCR反應(yīng)在ABI公司2720 PCR儀上進(jìn)行.配制PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(2.5 Mm)4 μL，引物(20 μM)1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，基因組DNA 50 ng，雙蒸水補(bǔ)足至50 μL.3種cpDNA基因片段的擴(kuò)增反應(yīng)程序分別如下：PsbA-trnH，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；RbcL，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，42 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；TrnL-F，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

采用質(zhì)量濃度10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測.

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆和測序 利用DNA片段純化試劑盒分別對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的基因片段連入克隆載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，根據(jù)氨芐抗性和藍(lán)白斑篩選陽性克隆子，同時采用PCR對相應(yīng)克隆菌株進(jìn)行鑒定.提取鑒定合格的重組質(zhì)粒送大連TaKaRa生物公司測序.

1.2.4 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將獲得的3種野生葡萄PsbA-trnH，RbcL和trnL-F序列送GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，用Blast搜索程序調(diào)出相似性較高的相關(guān)序列，使用Mega4軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建基于這3種cpDNA基因序列的3種野生葡萄及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值(bootstrap value)分析以評估系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與討論

2.1葉綠體基因片段的PCR擴(kuò)增及其序列同源性比較

通過PCR擴(kuò)增成功地從毛葡萄、刺葡萄和華南美麗葡萄中分離獲得3種cpDNA基因序列.其中3個PsbA-trnH基因片段序列長度分別為435 bp，432 bp，429 bp，它們之間同源性達(dá)到98%；3個RbcL基因片段序列長度為1 371 bp，1 376 bp，1 374 bp，它們之間同源性達(dá)到98%；3個trnL-F序列長度為952 bp，953 bp，950 bp，它們之間同源性達(dá)到99%.將各cpDNA基因片段送GenBank注冊，獲得Accession number(見表1)，憑證標(biāo)本均來自吉首大學(xué)植物標(biāo)本室.

2.2基于cpDNA基因序列的3種野生葡萄系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Blast搜索軟件在GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，調(diào)出相似性較高相關(guān)植物的PsbA-trnH，RbcL和trnL-F基因序列，采用相關(guān)軟件進(jìn)行序列比對、進(jìn)化距離矩陣計(jì)算和聚類分析，分別構(gòu)建了由毛葡萄、刺葡萄、華南美麗葡萄和與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切物種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(見圖1—3).

圖1 基于PsbA-trnH基因序列的毛葡萄、刺葡萄和華南美麗葡萄及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖1中，節(jié)點(diǎn)上數(shù)字為重復(fù)1 000次采樣分析的自展值(>50%)；標(biāo)尺為每100個核酸位點(diǎn)有2個核酸置換.在基于PsbA-trnH序列的進(jìn)化樹中，進(jìn)化樹總體聚為2大進(jìn)化分支，葡萄屬(Vitis)與爬山虎屬(Parthenocissus)、烏蘞莓屬(Cayratia)、崖爬藤屬(Tetrastigma)、蛇葡萄屬(Ampelopsis)5個屬聚于同一進(jìn)化分支，白粉藤屬(Cissus)2個種聚于另一進(jìn)化分支，說明葡萄屬與爬山虎屬、烏蘞莓屬、崖爬藤屬、蛇葡萄屬等4個屬具有比較近的親緣關(guān)系，而與白粉藤屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn).Leeaindica獨(dú)立成一進(jìn)化分支，形成外群，其結(jié)果支持了火筒樹屬(Leea)在形態(tài)學(xué)研究中與葡萄科其他屬具有較大進(jìn)化差異的結(jié)論[8-9].在葡萄屬的進(jìn)化分支中，3種野生葡萄聚在一起，與其他2個種葡萄圓葉葡萄(V.rotundifolia)和葛雃葡萄(V.flexuos)親緣性非常高，在進(jìn)化分支上平行存在.

圖2 基于RbcL基因序列的毛葡萄、刺葡萄和華南美麗葡萄及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2中，節(jié)點(diǎn)上數(shù)字為重復(fù)1 000次采樣分析的自展值(>50%)；標(biāo)尺為每1 000個核酸位點(diǎn)有2個核酸置換.基于RbcL序列的進(jìn)化樹總體聚為2大進(jìn)化分支，葡萄屬與爬山虎屬、崖爬藤屬聚于同一分支，蛇葡萄屬與酸蘞莓屬(Ampelocissus)、火筒樹屬聚于同一進(jìn)化分支.說明葡萄屬與爬山虎屬、崖爬藤屬具有較近的親緣關(guān)系，而與蛇葡萄屬和酸蘞莓屬進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn).在基于RbcL序列的進(jìn)化樹中，火筒樹屬并沒有像圖1一樣單獨(dú)聚于外群，而是與蛇葡萄屬和酸蘞莓屬聚于同一進(jìn)化分支，但仍然與其他屬進(jìn)化距離較遠(yuǎn).在葡萄屬的進(jìn)化分支中，3種葡萄分為2支，毛葡萄與華南美麗葡萄平行于一進(jìn)化分支，而刺葡萄與釀酒葡萄(V.vinifera)聚于同一進(jìn)化分支.

圖3 基于trnL-F基因序列的毛葡萄、刺葡萄和華南美麗葡萄及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3中，節(jié)點(diǎn)上數(shù)字為重復(fù)1 000次采樣分析的自展值(>50%)；標(biāo)尺為每1 000個核酸位點(diǎn)有2個核酸置換.基于trnL-F序列的進(jìn)化樹總體聚為2大進(jìn)化分支，葡萄屬與俞藤屬(Yua)、爬山虎屬、酸蘞莓屬、崖爬藤屬聚于同一進(jìn)化分支，而蛇葡萄屬獨(dú)立聚于另一進(jìn)化分支.火筒樹屬獨(dú)立于外群.在葡萄屬中，3種野生葡萄同聚于葡萄屬進(jìn)化分支，與細(xì)本葡萄(V.thunbergii)、桑葉葡萄(V.heyneana)和釀酒葡萄(V.vinifera)平行存在.

3 結(jié)論與分析

cpDNA主要由單拷貝序列構(gòu)成，在被子植物中因?yàn)槠鋯斡H遺傳，與核基因相比，不受到網(wǎng)狀進(jìn)化(reticulate evolution)的影響，容易分析其進(jìn)化歷史.PsbA-trnH是編碼光系統(tǒng)II蛋白D1(photosystem II protein D1，psbA)與tRNA-His基因之間的間隔序列，RbcL是核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase)的編碼序列，trnL-F 區(qū)包括trnL內(nèi)含子和trnL-trnF 之間的間隔區(qū).這3種cpDNA序列已被廣泛運(yùn)用于植物系統(tǒng)發(fā)育分析.PsbA-trnH適用于科內(nèi)屬間的分類，RbcL適用于科間的分類，而trnL-F較適用于屬內(nèi)種間的分類[4,10].

筆者認(rèn)為，基于3種不同cpDNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹屬間存在一定差異，但3株進(jìn)化樹都認(rèn)為葡萄屬與爬山虎屬和崖爬藤屬具有較近的親緣關(guān)系，而與蛇葡萄屬進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，這與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)中認(rèn)為葡萄屬與蛇葡萄屬應(yīng)有較近進(jìn)化關(guān)系，而與崖爬藤屬具有較遠(yuǎn)進(jìn)化關(guān)系的結(jié)論有所不同[11].PsbA-trnH，RbcL與trnL-F序列的進(jìn)化樹同時都認(rèn)為火筒樹屬應(yīng)該與整個葡萄科其他屬植物具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，這與一些形態(tài)學(xué)研究結(jié)果一致[8-9,11].

在基于PsbA-trnH和trnL-F的進(jìn)化樹中，均不能很好地顯示出葡萄屬種間的進(jìn)化關(guān)系，可能由于其DNA片段序列較短或者同源性非常高，不能提供足夠的信息來鑒別其種間差異.而基于RbcL的系統(tǒng)進(jìn)化分析中，測得的3種野生葡萄序列與GenBank/EMBL/DDBJ中其他葡萄種相應(yīng)序列能夠表現(xiàn)出種間的進(jìn)化差異，所以RbcL應(yīng)該能運(yùn)用于葡萄屬屬內(nèi)種間的分子鑒定.但由于目前收錄于GenBank/EMBL/DDBJ中的葡萄屬RbcL基因序列較少，因此無法對其進(jìn)行深入詳細(xì)研究.總之，結(jié)合植物形態(tài)學(xué)特征，PsbA-trnH與trnL-F序列能用于葡萄科植物科內(nèi)屬間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析；如果對葡萄屬種間進(jìn)行分子鑒定，可以采用RbcL基因序列及其他分子標(biāo)記.

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(責(zé)任編輯 易必武)

PhylogeneticAnalysisofThreeWildGrapesBasedonPsbA-trnH,RbcLandtrnL-FSequences

TANG Yuntao1,2,SU Guirong1,2,XIE Yu1,2,YI Langbo1,2

(1.College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China.2.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

PsbA-trnH,RbcL andtrnL-F fragments were amplified from the three wild grapes in Xiangxi Autonomous Prefecture by PCR,and cloned into pMD18-T vector for sequencing.Based onPsbA-trnH,RbcL andtrnL-F gene sequences,the phylogenetic trees between these three wild grapes and other relatedVitaceaeplants were constructed by software Mega4 for analyzing their phylogenetic relationship.The results showed that all of these three cpDNA fragments could be used as molecular markers in phylogenetic analysis among genera ofVitaceae,but of which results had a little difference from that of traditional morphological methods.Furthermore,RbcL gene fragment could be used for molecular identification amongVitisspecies.

wild grape；PsbA-trnH；RbcL；trnL-F；phylogeny

1007-2985(2014)02-0085-05

2013-12-30

湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)資助項(xiàng)目(13A078)

易浪波(1980-)，女，湖南婁底人，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院講師，主要從事植物生態(tài)學(xué)研究.

Q949.4

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.02.019