肖泓，曹明勤，張濤，王健,

(1. 杭州電子科技大學(xué) 電子信息學(xué)院，杭州 310018；2. 杭州聚光科技股份有限公司)

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肖泓1，曹明勤1，張濤2，王健1,2

(1. 杭州電子科技大學(xué) 電子信息學(xué)院，杭州 310018；2. 杭州聚光科技股份有限公司)

為了快速、定量檢測肉類食品中瘦肉精含量，采用了一種先進的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)進行檢測。首先將稀釋好的樣品滴加在用免疫層析技術(shù)制作的試紙卡上，然后使用638 nm波長的半導(dǎo)體激光器照射試紙卡，激發(fā)出的熒光通過光敏二極管接收，通過采集熒光強度來實現(xiàn)瘦肉精含量的檢測。通過實驗驗證,該檢測系統(tǒng)能夠快速、定量、精確的檢測瘦肉精的含量，檢測時間為6 s，測量量程為0.0～0.3 ppb，檢測靈敏度為0.01 ppb。

瘦肉精；激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)；免疫層析技術(shù)；半導(dǎo)體激光器；光敏二極管

引 言

本設(shè)計在傳統(tǒng)的免疫法基礎(chǔ)上進行改良，采用了激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)和熒光免疫分析法，實現(xiàn)了對瘦肉精的快速、定量、精確檢測，具有高分辨率、快速響應(yīng)、高靈敏度、抗干擾能力強等優(yōu)點。

1 檢測系統(tǒng)的工作原理與組成

1.1 光學(xué)檢測原理

本設(shè)計選用的半導(dǎo)體激光器的光功率最大是5 mW，最大工作電流是40 mA，正常工作電流35 mA，正常工作電壓是2.2 V，最大反向工作電壓是2 V，波長范圍是630～640 nm，中心波長為638 nm。激發(fā)出來的熒光波長為680 nm，所選用的光敏二極管S5106能夠感應(yīng)的波長范圍是320～1 100 nm，接收靈敏度最高的是960 nm的光，接收熒光的靈敏度約為0.45。

半導(dǎo)體激光器打出的638 nm波長的激光通過二向色鏡反射，反射的激光再通過透鏡1聚焦到檢測試紙卡上，這樣激光能量能夠最大化地聚集到試紙卡上，此時能最大激發(fā)出熒光；激發(fā)出來的680 nm的熒光通過二向色鏡透射，熒光照射到濾光片上，濾光片透過的光波長為660～700 nm，這樣不在這個波長范圍的雜散光就能被濾除掉；熒光再通過透鏡2聚焦到光闌上面的光孔，光闌也能擋住一部分雜散光，聚焦的熒光能夠最大化地聚集到光敏二極管的接收面上，這樣設(shè)計的光路不僅能夠很好地濾除雜散光，而且還能最大化地聚集激光能量和最大化地激發(fā)熒光，激發(fā)的熒光也能夠最大化地聚集到光敏二極管上，這樣能最有效地抑制噪聲、最有效地激發(fā)熒光和接收熒光，有利于熒光信號的采集和測量的精度提高。

光路檢測圖如圖1所示。

圖1 光路檢測圖

1.2 試紙卡制作原理

免疫層析技術(shù)是建立在層析技術(shù)和抗原-抗體特異性免疫反應(yīng)基礎(chǔ)上的一項新興免疫檢測技術(shù)。免疫層析技術(shù)以固定有檢測線T和控制線C的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，通過毛細(xì)作用使待測物在層析條上移動。其中待測物在T線處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。

常用免疫層析熒光法包括競爭法和夾心法，本設(shè)計檢測法采用競爭法，競爭法主要用于測量小分子抗原，如克倫特羅、萊克多巴胺等。競爭法試紙卡制作示意圖如圖2所示。

圖2 競爭法試紙制作示意圖

待測樣本中的抗原濃度越高，則熒光素標(biāo)記的抗原與單克隆抗體形成抗原抗體復(fù)合物的量就越少，T線上熒光免疫復(fù)合物的量也就越少，待測樣本中克倫特羅的濃度與T 線信號成負(fù)相關(guān)。而C線上捕獲的熒光素標(biāo)記兔抗信號值則相對固定。通過激光對檢測卡進行掃描，根據(jù)克倫特羅濃度與熒光信號強度成負(fù)相關(guān)，獲得待測樣本中克倫特羅的準(zhǔn)確濃度。

1.3 系統(tǒng)硬件設(shè)計

系統(tǒng)硬件主要由控制器、電源、激光器驅(qū)動與保護、步進電機驅(qū)動、信號處理及采集、按鍵與顯示屏等組成?？刂破鞑捎没贏RM Cortex-M4核的STM32F407VGT6，主頻頻率為168 MHz。主要硬件框圖如圖3所示。半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動采用恒流驅(qū)動，驅(qū)動電流值由控制器設(shè)定，激光誘導(dǎo)的熒光束通過光敏二極管接收后轉(zhuǎn)換成電流值，電流值轉(zhuǎn)換成電壓后經(jīng)過放大和濾波送到A/D芯片采集，采集后轉(zhuǎn)換成濃度值在顯示屏上顯示，實現(xiàn)定量檢測。試紙卡通過步進電機驅(qū)動做直線運動，實現(xiàn)整個試紙卡的掃描采樣。下面主要介紹半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電路和前置信號處理電路。

圖3 主要硬件框圖

1.3.1 半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電路

半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電路主要由電流源組成。激光器對電流沖擊的承受能力較差，電流微小的變化將引起光輸出的變化，這些變化有可能影響激光器的使用壽命，因此在實際應(yīng)用中對驅(qū)動電流源的性能和安全保護有很高的要求[4]。為了能夠很好地觀察熒光信號的強弱變化，設(shè)計激光器的電流源連續(xù)可調(diào)節(jié)，改變驅(qū)動電流大小，同時改變激光器的光功率。該電路的原理圖如圖4所示，電流源供電通過LDO給其供電，減小電源噪聲，使激光器工作在穩(wěn)定可靠條件下。

圖4 電流源電路原理圖

U1為數(shù)字轉(zhuǎn)化為模擬信號芯片，輸出電壓在0～4.096 V 可調(diào)，電流源由運算放大器U2A,精密電阻R1、R2、R4、R7和三極管Q1組成。原理如下，根據(jù)虛斷的概念可得：

(1)

(2)

根據(jù)虛斷可得：

(3)

其中R1=R2=R4=R7，由式(1)～式(3)可求得：

(4)

則b點的節(jié)點電流為：

(5)

將式(1)和式(4)代入可得：

(6)

由于R7>>30Ω，后面一項可忽略，得到半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電流為：

(7)

由式(7)可以得知，半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電流與激光器的阻抗無關(guān)，只與輸入電壓VIN和精密電阻R5、R6相關(guān)，驅(qū)動電流通過調(diào)節(jié)輸入電壓大小實現(xiàn)連續(xù)可調(diào)。

1.3.2 信號處理電路

光敏二極管的PN結(jié)有一個結(jié)電容和一個寄生電阻，結(jié)電容和采樣電阻組成了一個RC充電回路，RC值的大小決定了光敏二極管的響應(yīng)速度。光敏二極管在反向偏置電壓作用下工作，再加上寄生電阻的存在，在沒有光信號輸入時，光敏二極管仍然會流出電流，該電流稱為暗電流。S5106的暗電流正常值為0.2nA。由于結(jié)電容的存在，該結(jié)電容延遲了信號的響應(yīng)，在輸出信號端會產(chǎn)生震蕩，在取樣電阻R2上需并聯(lián)一個合適容值的電容C4用來對電路進行補償，消除信號的震蕩。

當(dāng)激光照射在試紙卡上時，激發(fā)出來的熒光反射到S5106上形成光電流，通過電阻R2實現(xiàn)I/V轉(zhuǎn)換，將電流轉(zhuǎn)換成電壓值。由于熒光信號非常微弱，產(chǎn)生的光電流值一般都為幾個nA，再加上運算放大器輸入級偏置電流的存在，為減小偏置電流對光電流的影響，一般需要選取偏置電流極小的運算放大器，可選取pA級別的。其中I/V轉(zhuǎn)換原理圖如圖5所示。

圖5 I/V轉(zhuǎn)換原理圖

1.4 系統(tǒng)軟件設(shè)計

1.4.1 系統(tǒng)軟件總流程

系統(tǒng)軟件設(shè)計采用C語言開發(fā)，主程序結(jié)構(gòu)如圖6所示。儀器上電后，進行系統(tǒng)初始化，讀取外部EEPROM的保存參數(shù)，接著系統(tǒng)開始自檢，液晶屏顯示“系統(tǒng)自檢中”。自檢內(nèi)容包括電源自檢、外部RTC自檢、外部EEPROM自檢、電機自檢、激光器自檢、電路自檢、溫度傳感器自檢。自檢不通過，則報警，液晶屏顯示相應(yīng)的報警碼，否則進入主菜單界面。在主菜單頁面中，在“測試”頁面中按下ENTER鍵進入測試流程，在“查詢”頁面中按下ENTER鍵進入歷史記錄流程，在“設(shè)置”頁面中按下ENTER鍵則進入設(shè)置流程。在設(shè)置頁面中，在“時間與日期”頁面中按下ENTER鍵進入設(shè)置時間與日期流程。在“清空歷史記錄”頁面中按下ENTER鍵進入清空歷史記錄流程。在“信息”頁面中按下ENTER鍵查看儀器的基本信息。

圖6 主程序結(jié)構(gòu)

1.4.2 尋峰算法

(1) 尋峰要求

① 任意尋峰范圍：通過測試試紙條得知，共300個點，從START到END，如200～500。

② 若為選取的峰，則峰高必須大于一個閾值THRESHOLD，如100 mV。

③ 尋峰完畢后，峰的個數(shù)必須為2個，否則尋峰失敗。

④ 峰的寬度通過測試試紙得知，是一個定值WIDTH，如60。

⑤ 通過計算峰高之比來求得比值。

⑥ 可在本底不平滑的情況進行。

(2) 自動尋峰算法

自動尋峰方法有多種,如高斯乘積函數(shù)法，導(dǎo)數(shù)法(一階、二階、三階)，對稱零面積法，協(xié)方差法等。其中，高斯乘積函數(shù)尋峰法可靠性較差；導(dǎo)數(shù)法(一階、二階、三階)，比較簡單；對稱零面積法可準(zhǔn)確識別弱峰；協(xié)方差法較為復(fù)雜。而這些高級的尋峰方法主要用于光譜分析中識別弱峰、重峰、假峰等。

本設(shè)計采用常見的一階導(dǎo)數(shù)法來進行自動尋峰，該方法非常簡單且比較準(zhǔn)確，很容易在嵌入式處理器中用軟件實現(xiàn)。

自動尋峰算法流程如下：

① 取得300點尋峰范圍內(nèi)的各索引值的電壓值V。

② 分別求得(300-1)個相鄰數(shù)值之間的差值d。

③ 在(WIDTH/2，END-START-WIDTH/2)范圍內(nèi)開始尋峰。

④ 取得極大值后，其索引值為i，分別求得左右索引值LEFT和RIGHT。

⑤ 通過左右索引值及各對應(yīng)的電壓值擬合一條直線，并求出i+1處對應(yīng)的峰高。

⑥ 若該峰高大于閾值THRESHOLD,且峰的個數(shù)≤2， 則將該峰高存入數(shù)組中，并將索引值i加上WIDTH/2。

⑦ 尋峰完畢或者出現(xiàn)峰的個數(shù)大于2，則退出尋峰。

⑧ 尋峰結(jié)束后，如果峰的個數(shù)為2個，則通過計算峰高的比值即C/T，將該比值代入公式中即可求出待測物質(zhì)的濃度值。

導(dǎo)數(shù)法示意圖如圖7所示。

圖7 導(dǎo)數(shù)法示意圖

2 系統(tǒng)測試結(jié)果

試紙卡在步進電機的驅(qū)動下做直線運動，通過光學(xué)檢測系統(tǒng)對其進行逐步掃描和信號采集，采集到的信號值通過上位機軟件顯示，采樣到的信號值在T線和C線處形成兩個波峰，克倫特羅的濃度與T線信號成負(fù)相關(guān)，而C線上捕獲的熒光素標(biāo)記兔抗信號值則相對固定，C線峰值用作參照，通過尋找T線和C線處的峰值，再通過T線和C線峰值的比值來計算克倫特羅的濃度。

現(xiàn)以測試的一組克倫特羅濃度值為例，采樣到的信號值上位機顯示波形圖如圖8所示。檢測時間總共耗時6 s，其中橫坐標(biāo)為采樣的點數(shù)，總共采樣1 500個點，1 ms采樣一個點，縱坐標(biāo)為每點所對應(yīng)的采樣電壓值，兩個波峰分別為T線和C線處的波峰，T線所對應(yīng)的峰高與被測樣品濃度成負(fù)相關(guān)，C線所對應(yīng)的峰高是用作參照的，用來消除背景干擾。

圖8 采樣波形圖

結(jié) 語

本文介紹了一種以激光技術(shù)、熒光免疫層析技術(shù)和激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)為基礎(chǔ)的定量瘦肉精檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)實現(xiàn)了瘦肉精的快速定量檢測，檢測靈敏度達到了0.01 ppb，同時檢測時間短，能夠大批量檢測，是一個實用且完整的系統(tǒng)，對瘦肉精的精確檢測具有很大的參考意義。

[1] 張振亞，梅興國. 現(xiàn)代熒光免疫分析技術(shù)應(yīng)用及其新發(fā)展[J].生物技術(shù)通訊，2006(4).

[2] 劉舒書，單文濤．一種實用的大功率激光二極管驅(qū)動電源[J]．激光與紅外，1998，28(3):153-155.

[3] 江文杰，曾學(xué)文，施建華．光電技術(shù)[M]．北京：科學(xué)出版社，2009.

[4] 樸德慧，郭玉彬，王天樞.大功率半導(dǎo)體激光器驅(qū)動電路及防護[J].激光與紅外，2007,37(3):230-233.

肖泓、曹明勤(碩士研究生)，主要研究方向為電路與系統(tǒng)；張濤(總工)、王健(教授)，主要研究方向為儀器儀表。

Xiao Hong1,Cao Mingqin1, Zhang Tao2,Wang Jian1,2

(1. School of Electronic Information, Hangzhou Electronic Science Technology University,Hangzhou 310018, China; 2. Hang Zhou Focused Photonics Inc.)

In order to detect concentration of clenbuterol fast and quantitatively in meat food, we adopt an advanced laser induced fluorescence technique. First, a diluted sample is dropped on the reagent card made by immunochromatographic technique. Then we irradiates the reagent card with a 638 nm wavelength laser diode to excite the fluorescence received by the photodiode. Finally, the author collects the fluorescence intensity to achieve the detection of clenbuterol's concentration. Experiment shows that the detection system is rapid and quantitative, accurate in detection of concentration of clenbuterol. Detection time is 6, the measurement range is 0.0～0.3 ppb and detection sensitivity is 0.01 ppb.

clenbuterol; laser induced fluorescence technique; immunochromatography technique; laser diode; photodiode

TN98

A

迪娜

2013-11-01)