潘新民，徐國輝，秦豪杰，高林波，張 林

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

胃癌中CDK6mRNA表達(dá)變化研究

潘新民1，徐國輝1，秦豪杰1，高林波2，張 林3

目的探討胃癌中CDK6 mRNA含量的變化。方法采用實時熒光定量PCR檢測胃癌及癌旁組織中CDK6 mRNA的表達(dá)。結(jié)果胃癌組織中CDK6 mRNA 含量為0.433±0.468，癌旁組織為1.304±1.206，兩組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論CDK6 mRNA在胃癌癌旁組織表達(dá)水平明顯高于癌組織。

胃癌；CDK6；實時熒光定量PCR

CDKs是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，失活或異常表達(dá)時可導(dǎo)致細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化[1]。CDK6是調(diào)控細(xì)胞G1-S期關(guān)鍵因素之一[2]，人類許多腫瘤的發(fā)生與CDK4或CDK6(Cyclin dependent kinase 6,CDK6)相關(guān)[3-6]。研究發(fā)現(xiàn)CDK6蛋白在肝癌[7]、淋巴癌[8]、宮頸癌[9]、皮膚瘢痕癌[10]等表達(dá)呈弱陽性至表達(dá)增強，而在88%的腸癌組織[11]、69%的胃癌組織中[12]等呈陽性表達(dá)，但未見有相關(guān)CDK6 mRNA定量的報道。通過實時熒光定量PCR技術(shù)通過反轉(zhuǎn)錄RNA，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實時監(jiān)測cDNA的放大[13]。因為擴(kuò)增指數(shù)增長期測量值與特異cDNA(RNA)起始量存在相關(guān)性，在擴(kuò)增的指數(shù)增長期測量擴(kuò)增產(chǎn)物實現(xiàn)定量檢測[14]。本研究運用實時熒光定量PCR檢測CDK6 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)，為探索CDK6在胃癌發(fā)病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 PrimerScriptTMRT reagent Kit(Takara Co.,Japan)，SYBR?PremixExTaqTMⅡ Kit(TaKaRa Co.,Japan)，RNAiso Reagent(Takara Co.,Japan)DEPC (GIBCO Co.,USA)，異丙醇、氯仿、無水乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗儀器 ABI 7500熒光 RT-PCR儀(ABI Co.,USA)，低溫高速離心機(Eppendorf Co.,Germany)，微量移液器(Eppendorf Co.,Germany)，XH-89旋渦振蕩器(浙江樂清儀器廠)，NANODROP 1000超微量紫外分光光度計(Thermo Scintific,USA)，-80℃冰箱 (SANYO Co.,Japan)，BS210S型電子天平(Sartorius Co.,USA)，純水體系(MilliPure Co.,France)，超聲勻漿器(寧波新芝公司)。

1.1.3 組織標(biāo)本 采集胃癌癌組織及癌旁組織13例，男性6例，女性7例，平均年齡(61.8±11.4)歲。

1.2 方法

1.2.1 胃癌組織標(biāo)本總RNA提取 操作簡介：取經(jīng)DEPC處理干燥的EP管置于冰上，每管加入500 μL RNAisoTM Plus，分別取20 mg胃癌癌組織及癌旁組織，超聲勻漿后靜置5 min。12 000 g 4℃離心5 min。移液器吸出上清加入氯仿(RNAisoTM Plus的20%體積量)，振蕩充分乳化后離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置10 min。離心10 min后棄上清，緩慢加入75%乙醇1 mL。離心5 min，室溫下干燥沉淀5 min，加入30 μL DEPC雙蒸水，待RNA沉淀完全溶解后-80℃保存。抽取1 μL采用NANODROP 1000超微量紫外分光光度計進(jìn)行RNA定量檢測。

1.2.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按PrimerScriptTMRT reagent Kit組份配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(在冰盤上操作)：5×PrimeScriptTM Buffer 2 μL， PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL，充分混勻，按照37℃ 15 min，85℃ 5 s進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測CDK6 mRNA胃癌中的表達(dá) ①引物的設(shè)計與合成：根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中CDK6基因mRNA的序列(AK313491)設(shè)計CDK6的引物如下：

上游引物: 5’-TCAGGTTGTTTGATGTGTGC-3’

下游引物: 5’-TCCTTTATGGTTTCAGTGGG-3’

根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因mRNA的序列(AF261085)設(shè)計GAPDH的引物如下：

上游引物: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’

下游引物: 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

②實時熒光定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：以單鏈cDNA作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，分別擴(kuò)增CDK6和GAPDH， PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定條帶位置與大小正確后，參照BioTake PCR產(chǎn)物回收試劑盒中的操作說明，回收、純化PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序證實其序列與GeneBank中CDK6及GAPDH序列一致。將所得樣品用easy dilution RNase水1、10、100、1 000、10 000和100 000倍等比稀釋，制作成為標(biāo)準(zhǔn)品用于real time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。③待測組織中CDK6 mRNA 檢測和定量分析：采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，按照Takara Co.SYBR?PremixExTaqTMⅡ說明書進(jìn)行操作。使用20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行real time PCR檢測胃癌及癌旁組織CDK6 mRNA含量。充分混勻后，在ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀上，設(shè)置反應(yīng)條件：95℃10 s，95℃5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后增加融解。曲線分析：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s；每個樣本復(fù)孔3個，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線、融解曲線和樣本的相對定量。每個樣本的內(nèi)參基因GAPDH在相同條件下擴(kuò)增，附加陰性對照作為質(zhì)量控制。統(tǒng)一基線基準(zhǔn)，在與基線交點的循環(huán)次數(shù)(Ct) 值為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)管濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇PCR基線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和修正，根據(jù)待測樣本的Ct 值求出相應(yīng)基因的相對表達(dá)量。以標(biāo)本CDK6相對表達(dá)量/對應(yīng)GAPDH相對表達(dá)量，得到校正后每個樣本CDK6 mRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR引物特異性驗證在260 nm和280 nm超微量紫外分光光度計測定吸光值，提取的純RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.1之間。融解曲線分析實時熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及引物二聚體，驗證PCR產(chǎn)物的特異性。本組數(shù)據(jù)顯示融解曲線單一峰型，說明CDK6與GAPDH熒光定量PCR擴(kuò)增引物特異性好，未見引物二聚體等非特異性擴(kuò)增。

2.2 實時熒光定量PCR擴(kuò)增效率檢測取1份樣品，分別做1、10、100、1 000、10 000和100 000倍等比稀釋，然后分別作目的基因CDK6和內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增完成后，可直接測出CDK6和GAPDH對應(yīng)的R2，分別為0.994和0.996，斜率分別為-3.336和-3.359。根據(jù)公式E=10-1/K-1(E為擴(kuò)增效率，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計算得到擴(kuò)增效率分別為：99.42%(CDK6)和98.48%(GAPDH)，符合相對定量法的使用斜率。

2.3 CDK6在結(jié)直腸癌和胃癌組織中的表達(dá)CDK6 mRNA在胃癌癌旁組織表達(dá)水平為1.304±1.206，明顯高于癌組織0.433±0.468(t=-2.669，P=0.02)。

3 討論

在不同腫瘤或腫瘤的不同類型中CDK6的表達(dá)可能并不相同，在子宮內(nèi)膜腺癌[9，16]、鼻咽癌[17]CDK6表達(dá)增高，并且與腫瘤分化程度和臨床分期等有關(guān)，但在不同的淋巴瘤中，CDK6的表達(dá)并不相同[8，15]。在88%的腸癌組織[11]、69%的胃癌組織中[12]等呈陽性表達(dá)。有研究使用CDK6 mRNA探針顯示有少部分肝癌細(xì)胞CDK6 mRNA呈弱陽性表達(dá)[7]，可能與抑制因子的缺失或mRNA降解有關(guān)，使CDK6 蛋白的表達(dá)異常，出現(xiàn)細(xì)胞增殖、腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤等。通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)CDK4 mRNA在鼻咽癌[18]和乳腺癌[19]中的表達(dá)上調(diào)，并且與部分臨床特征呈正向相關(guān)趨勢。然而，尚未見CDK6 mRNA在胃癌中的表達(dá)研究。

熒光染料能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要設(shè)計探針，檢測成本相對較低。但因為它能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合而產(chǎn)生假陽性信號。對于引物二聚體非特異性結(jié)合常使用融解曲線分析擴(kuò)增的特異性。實驗顯示融解曲線僅呈現(xiàn)單一平滑峰型時，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品重合良好，表明擴(kuò)增特異性良好[20]。PCR閾值是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值設(shè)置一般是3～15個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以未知樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出該樣品的起始拷貝數(shù)[21]。本研究采用GAPDH作為內(nèi)參[22]，CDK6與GAPDH融解曲線呈單一平滑峰型，擴(kuò)增效率均衡一致，復(fù)孔均一性好，閾值在正常范圍內(nèi)。

本研究檢測到CDK6 mRNA在胃癌癌旁組織中表達(dá)明顯高于癌組織，考慮到本研究抽樣及樣本含量，擴(kuò)大樣本量或運用其他實驗方法驗證將有助于了解其發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)機制。

[1]Evan GI,Vousden KH.Proliferation,cell cycle and apoptosis in cancer[J].Nature,2001,411(6835):342-348.

[2]高燕,林莉萍,丁健.細(xì)胞周期調(diào)控的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2005,17(4):318-322.

[3]Tsuda H,Yamamoto K,Inoue T,et al.The role of p16-cyclin d/CDK-pRb pathway in the tumorigenesis of endometrioid-type endometrial carcinoma[J].Br J Cancer,2000,82(3):675-682.

[4]Cram EJ,Liu BD,Bjeldanes LF,et al.Indole-3-carbinol inhibits CDK6 expression in human MCF-7 breast cancer cells by disrupting Sp1 transcription factor interactions with a composite element in the CDK6 gene promoter[J].J Biol Chem,2001,276(25):22332-22340.

[5]Retzer-Lidl M,Schmid RM,Schneider G.Inhibition of CDK4 impairs proliferation of pancreatic cancer cells and sensitizes towards TRAIL-induced apoptosis via downregulation of survivin[J].Int J Cancer,2007,121(1):66-75.

[6]Yu Q,Sicinska E,Geng Y,et al.Requirement for CDK4 kinase function in breast cancer[J].Cancer Cell,2006,9(1):23-32.

[7]鄭美蓉,阮慶大,程玲,等.CyclinD1、CyclinE、CDK6在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)[J].臨床肝膽病雜志,2006,22(1):49-51.

[8]Chilosi M,Doglioni C,Yan Z,et al.Differential expression of cyclin-dependent kinase 6 in cortical thymocytes and T-cell lymphoblastic lymphoma/leukemia[J].Am J Pathol,1998,152(1): 209-217.

[9]王輝,沈樹娜,王俊飛.宮頸癌組織中CDK6的表達(dá)及臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(34):60-62.

[10]林宇靜,郭瑞珍.皮膚瘢痕癌中CDK4、CDK6蛋白的表達(dá)及意義[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,36(1): 29-31,36.

[11]劉壽行,劉展,謝雪飛,等.大腸癌組織中CDK6、Ki67表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2012,9(1):76-80.

[12]姜可偉,王杉,葉穎江,等.胃癌組織中細(xì)胞周期蛋白d1和細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶6的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[J].中華普通外科雜志,2005,20(12):800-802.

[13]VanGuilder HD,Vrana KE,Freeman WM.Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis[J].Biotechniques,2008,44(5):619-626.

[14]Karlen Y,McNair A,Perseguers S,et al.Statistical significance of quantitative PCR[J].BMC Bioinformatics,2007,8:131.

[15]姜余梅,楊晶,楊琨.NK/T細(xì)胞淋巴瘤中CDK6的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥,2009,49(39):77.

[16]廖秀芳,林宇靜,曹婉維.CyclinD1、Cdk6在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)與臨床意義[J].中國實用醫(yī)藥,2013,8(8):27-28.

[17]羅小鵬,覃繼新,黃永秩,等.CDK6在鼻咽癌中的表達(dá)及臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,33(12):1811-1814.

[18]陳衍,麥春平,姚開泰,等.CDK4 mRNA在鼻咽癌的表達(dá)及臨床意義[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2013,29(1):89-92.

[19]陸輝,王水,王鋒.乳腺癌組織中CDK4 mRNA的表達(dá)及意義[J].江蘇醫(yī)藥,2008,34 (10):1008-1009.

[20]Udvardi MK,Czechowski T,Scheible WR.Eleven golden rules of quantitative RT-PCR[J].Plant Cell,2008,20(7):1736-1737.

[21]Rutledge RG,Cote C.Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves[J].Nucleic Acids Res,2003,31(16):e93.

[22]Bustin SA.Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR):trends and problems[J].J Mol Endocrinol,2002,29(1):23-39.

TheExpressionofCDK6mRNAinGastricCancer

PAN Xin-min,XU Guo-hui,QIN Hao-jie,et al

(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo explore the expression ofCDK6 mRNA in gastric cancer.MethodsThe expression ofCDK6 mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR with GAPDH as an internal reference.ResultsThe expression ofCDK6 mRNA was 0.433±0.468 in gastric cancer tissues and 1.304±1.206 in normal adjacent tissues respectively.It was statistically significant between gastric cancer tissues and normal adjacent tissues (P<0.05).ConclusionThe expression ofCDK6 mRNA is higher in normal adjacent tissues of gastric cancer than that in cancer tissues.

gastric cancer;cyclin dependent kinases 6;real-time fluorescence quantitative PCR

國家自然科學(xué)基金項目(81302149)， 河南省科技廳自然科學(xué)基金項目(132300410105)

2014-01-10

1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003 2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川成都 610041 3.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041

潘新民(1969-)，男，河南洛陽人，副教授，從事法醫(yī)病理、分子病理學(xué)工作。

張林，男，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：zhanglin@scu.edu.cn

Q754，R735.2

A

1672-688X(2014)02-0081-03