禚銀玲 郭其森

肺癌是當今世界上最常見的癌癥，每年約有100萬患者被診斷為肺癌，并且是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中約半數(shù)以上的患者在診斷時已屬晚期，因此化療是最主要的治療方案[2]。在臨床應用中，鉑類聯(lián)合化療已經(jīng)成為NSCLC的標準化療方案，然而由于腫瘤耐藥的出現(xiàn)，使得絕大部分腫瘤很快出現(xiàn)復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移。從而限制了許多化療藥物例如紫杉醇、多西他賽和長春瑞濱等微管結(jié)合藥物在NSCLC治療的臨床應用[3,4]。

微管（microtubule）是構(gòu)成細胞骨架的主要成分，微管蛋白分為α、β兩個亞型，由α-tubulin和β-tubulin形成的異二聚體組裝成的多聚體，具有維持細胞形態(tài)，進行物質(zhì)交換，傳遞信息，參與有絲分裂等重要功能[5,6]。NSCLC中βIII-tubulin表達與腫瘤的分化程度和分級有關(guān)，表達越高，腫瘤的分化越差、分級越高，并且腫瘤轉(zhuǎn)移潛力增加[7,8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)NSCLC在腺癌組織中的βIII-tubulin表達水平較鱗癌和其它組織學類型高。

β-tubulin是抗微管藥物的主要細胞靶點。其中βIII-tubulin高表達NSCLC細胞株和卵巢癌細胞株的耐藥有關(guān)[10,11]。RNA干擾（RNA interference, RNAi）在探索基因功能、基因治療、病毒性疾病、傳染性疾病以及腫瘤的治療領(lǐng)域有廣泛應用。與傳統(tǒng)反義核酸進行轉(zhuǎn)錄后基因沉默相比，能高效地特異性抑制目的基因。設計更簡便、作用迅速、效果明顯，能根據(jù)不同病情，設計個體化治療方案。

本研究利用RNA干擾技術(shù)沉默人肺腺癌A549/Taxol細胞中βIII-tubulin基因的表達，探討靶基因下調(diào)后對化療藥物紫杉醇的敏感性的變化以及對細胞周期和細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 人肺腺癌耐紫杉醇A549細胞株（A549/Taxol）來自山東省腫瘤醫(yī)院中心實驗室，A549/Taxol在0.2 μg/mL的Taxol中正常生長。DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），OPTI-MEM培養(yǎng)液（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）；βIII-tubulin siRNA序列（上海吉瑪公司）， PCR引物（上海生物工程公司）；RT-PCR試劑：Lipofectamine 2000、Trizol試劑（invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒ScriptTMRT reagent kit以及SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）（TaKaRa公司）；Western blot試劑：βIII-tubulin鼠抗人單抗（Abcam公司），β-actin鼠抗人單抗（Amersham Biosciences公司），羊抗人二抗（中杉公司）；紫杉醇（paclitaxel）（四川太極制藥有限公司），-20oC凍存。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549/Taxol細胞株在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37oC、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 人工合成βIII-tubulin siRNA序列 根據(jù)Genebank βIII-tubulin mRNA序列和siRNA的設計原則，人工設計合成3對βIII-tubulin siRNA序列和1對陰性對照siRNA序列：βIII-tubulin siRNA sense 5’-UCUCUUCAGGCCUGACAAUTT-3’，antisense 5’-AUUGUCAGGCCUGAAGAGATT-3’；βIII-tubulinsiRNA sense 5’-GACCUCAACCACCUGGUAUTT-3’，antisense 5’-AUACCAGGUGGUUGAGGUCTT-3’；βIII-tubulin siRNA sense 5’-GCACGUUGCUCAUCAGCAATT-3’，antisense 5’ UUGCUGAUGAGCAACGUGCTT-3’；Negative control siRNA sense 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，antisense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染 采用陽性脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天將對數(shù)生長期的A549/Taxol細胞接種于6孔板，調(diào)整細胞密度為1×105/mL，設siRNA組：（βIII-tubulin siRNA-1組、βIII-tubulin siRNA-2組、βIII-tubulin siRNA-3組）、陰性對照組（Negative control siRNA）、mock組（只含轉(zhuǎn)染試劑）和空白對照組（non-transfection）。將6孔板置于37oC、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。次日，待細胞生長至70%-80%融合時，按說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染5 h后更換為全培養(yǎng)液。

1.5 實時熒光定量RT-PCR檢測βIII-tubulin mRNA表達 轉(zhuǎn)染48 h后TRIzol法提取細胞內(nèi)總RNA，參照TRIzol Reagent說明書分別提取6組細胞內(nèi)總RNA，檢測總RNA純度及濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，體系如下：5×Prime ScriptTMBuffer 2 μL，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer （50 μM） 0.5 μL，Random 6 mers(100 μM) 0.5 μL，Total RNA 500 ng，Rnase free dH2O至10 μL。反應條件：37oC 15 min，85oC 5 s。對各組細胞反轉(zhuǎn)錄合成的βIII-tubulin cDNA模板進行PCR擴增反應，β-actin為內(nèi)對照。引物序列如下：βIII-tubulin：Forward primer 5'-GGAGATCGTGCACATCCAG-3'，Reverse primer 5'-TCGATGCCATGCTCATCAC-3'；β-actin：Forward primer 5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，Reverse primer 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。實時熒光qPCR反應體系（50 μL）如下：SYBR? Premix Ex TaqTM（2×）25.0 μL，PCR Forward Primer（10 μM） 1.0 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）1.0 μL，ROX Reference Dye（50×），1.0 μL，DNA模板4.0 μL，dH2O（滅菌蒸餾水）18.0 μL，Total 50.0 μL。擴增反應條件：95oC 10 s 1個循環(huán)，95oC 5 s 40個循環(huán)，60oC 31 s 40個循環(huán)。

擴增結(jié)束后excell軟件分析計算Ct值、△Ct、△△Ct、2-△△Ct，△Ct=CtβIII-tubulin-Ctβ-actin，△△Ct=實驗組△Ct-對照組△Ct，并計算βIII-tubulin mRNA含量。

1.6 Western blot檢測βIII-tubulin蛋白表達 用RT-PCR法篩選的有效βIII-tubulin siRNA-1序列6孔板轉(zhuǎn)染細胞，設對照組。48 h后，提取細胞總蛋白，測定總蛋白濃度，蛋白質(zhì)變性；電泳分離蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)膜將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜；4oC封閉過夜；加入βIII-tubulin鼠抗人一抗（1:2,000）、β-actin一抗（1:2,000），室溫孵育2 h，洗膜3次10 min/次；加入羊抗人二抗（1:2,000），室溫孵育2 h，T洗膜3次10 min/次；顯色；曝光；常規(guī)顯影定影；Bio2rad圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。β-actin為內(nèi)對照。

1.7 MTT法檢測紫杉醇對A549/Taxol細胞的敏感性 轉(zhuǎn)染48 h后，收集處于對數(shù)生長期的細胞，制成為1×105/mL的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，紫杉醇設6個濃度倍比稀釋等級，每濃度設3個復孔。待細胞貼壁后加入不同濃度Taxol（1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL）。于37oC、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h；加入MTT溶液（5 mg/mL）每孔10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；加10%SDS-HCL每孔100 μL；24 h后用Bio-rad 450型酶標儀測各孔吸光度（A），檢測波長為570 nm，參考波長為630 nm。按下式計算各濃度條件下細胞抑制率（inhibitory rate, IR），IC=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。Excell軟件繪制濃度效應曲線，實驗重復3次。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡（Annexin V-FITC法） Taxol誘導處理細胞48 h后，制備細胞懸液，PBS溶液洗滌2次，1,000 rpm離心5 min，PBS溶液重懸細胞調(diào)整細胞密度為1×106/mL，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明操作，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率。

1.9 流式細胞儀檢測細胞周期 Taxol誘導處理細胞48 h后，制備細胞懸液，PBS溶液洗滌，1,000 rpm離心5 min，PBS溶液重懸細胞調(diào)整細胞密度為1×106/mL，1,000 r離心5 min，棄去PBS，加入預冷70%乙醇固定，4oC過夜。加入碘化丙啶緩沖液500 μL/孔，4oC避光30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.10 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 βIII-tubulin siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)A549/Taxol細胞中βIII-tubulin mRNA表達 與NC siRNA組、mock、non-transfection組比較，βIII-tubulin siRNA-1、βIII-tubulin siRNA-2、βIII-tubulin siRNA-3組的mRNA表達水平均有不同程度的下調(diào)（P＜0.05），其中βIII-tubulin siRNA-1組的抑制率最高，為（87.73±4.87）%（P＜0.01）（圖1 ）。

2.2 βIII-tubulin siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)A549/Taxol細胞中βIII-tubulin蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示：βIII-tubulin siRNA組可見到分子量為51 kDa左右微弱的βIII-tubulin特異性條帶和β-actin條帶，其靶蛋白表達量較對照組明顯減少，而β-actin條帶與對照組基本一致。這與βIII-tubulin mRNA表達減少結(jié)果相一致（圖2）。

2.3 βIII-tubulin下調(diào)增加A549/Taxol細胞對紫杉醇的敏感性 MTT法檢測結(jié)果顯示，βIII-tubulin siRNA轉(zhuǎn)染A549/Taxol細胞后，紫杉醇對βIII-tubulin siRNA組的細胞抑制率明顯高于對照組（51.77±4.60）%（P＜0.01），且20 μg/mL時抑制率明顯（圖3）。

2.4 A549/Taxol細胞βIII-tubulin下調(diào)增加紫杉醇誘導的細胞凋亡 流式細胞儀檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示紫杉醇作用后βIII-tubulin siRNA組細胞早期凋亡率較對照組明顯增加（P＜0.05），其中Taxol為20 μg/L最明顯，兩組的早期凋亡率分別為（40.12±3.86）%、（21.47±5.44）%，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）（圖4）。

2.5 βIII-tubulin siRNA轉(zhuǎn)染后檢測紫杉醇對A549/Taxol細胞的細胞周期影響 細胞周期檢測結(jié)果顯示，紫杉醇處理細胞組的G2/M期細胞百分率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明紫杉醇將細胞阻滯在G2/M期，可能與誘導細胞凋亡有關(guān)，且紫杉醇處理轉(zhuǎn)染組后細胞晚期凋亡率較對照組增加（圖5）。

圖 1 轉(zhuǎn)染后A549/Taxol細胞中βIII-tubulin mRNA含量。*：與對照組相比，P＜0.05；#：與βIII-tubulin siRNA-2、βIII-tubulin siRNA-3組相比，P＜0.05。βIII-tubulin siRNA-1組的抑制率最高（87.73±4.87）%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Fig 1 Expression of βIII-tubulin mRNA in A549/Taxol after transfection detected by qRT-PCR. *: compared with the control, P＜0.05； **: compared with the control, P＜0.01； #: compared with βIII-tubulin siRNA-2, βIII-tubulin siRNA-3, P＜0.05. βIII-tubulin siRNA-1 sequence showed the highest transfection efficiency, (87.73±4.87)%. The difference was statistically significant compared with control.

圖 2 Western blot檢測蛋白的βIII-tubulin表達。與對照組相比，βIII-tubulin siRNA-1組靶蛋白表達水平明顯減少。Fig 2 Expression of βIII-tubulin protein level detected by Western blot. Compared with the control group, protein expression of βIII-tubulin siRNA-1 after transfection was significantly reduced.

圖 3 MTT法檢測紫杉醇處理轉(zhuǎn)染組后細胞抑制率曲線。轉(zhuǎn)染組細胞抑制率較對照組增加（P＜0.01），且10 μg/mL、20 μg/mL時，抑制率最明顯（P＜0.01）。**P＜0.01, *P＜0.05。Fig 3 Inhibition ratio assays on βIII-tubulin siRNA induced by paclitaxel. The inhibition ratio of βIII-tubulin siRNA group was higher than that of control group (P＜0.05 ). And it has obviously increased with 10 μg/mL and 20 μg/mL (P＜0.01). **P＜0.01, *P＜0.05.

圖 4 紫杉醇誘導轉(zhuǎn)染后A549/Taxol細胞的早期凋亡率。轉(zhuǎn)染組細胞早期凋亡率較對照組增加（P＜0.05）。且20 μg/mL時抑制率明顯（P＜0.01）。Fig 4 Apoptosis ratio induced by taxol on A549/Taxol transfected by βIII-tubulin siRNA. The early apoptosis rate of transfected group were higher than that of control group (P＜0.05). And it has the significantly increased in 20 μg/mL (P＜0.01). #P＜0.01, *P＜0.05.

圖 5 紫杉醇處理后各細胞組細胞周期分析。紫杉醇處理組G2-M期細胞比例較未處理組明顯增高（P＜0.05）。且βIII-tubulin siRNA+Taxol組細胞晚期凋亡率較對照組增加。Fig 5 Cell cycle assays of A549/Taxol on effect of taxol. G2-M content induced by paclitaxel is obviously increased than untreated samples. And the apoptosis rate of βIII-tubulin siRNA+Taxol group were higher than that of control group.

3 討論

腫瘤耐藥是影響肺癌患者化療療效的主要因素。影響NSCLC耐藥的因素主要有多藥耐藥（multi-drug resistant, MDR）基因、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multi-drug resistant related protein, MRP）基因及它們產(chǎn)物表達的增加，以及拓撲異構(gòu)酶II（Topoisomerase II, Topo II）表達下降和谷胱甘肽（Glutathione, GSH）及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase, GST）系統(tǒng)表達增加。此外研究[12]表明，細胞信號轉(zhuǎn)導中相關(guān)因子的表達異常、腫瘤細胞DNA修復的異常及其他相關(guān)基因的表達異常與肺癌耐藥的產(chǎn)生也存在密切聯(lián)系。因此篩選有效的分子指標，以預測患者對藥物的敏感性,可以更好的指導個體化治療、提高化療療效。

微管是細胞骨架的重要構(gòu)成成分，對維持細胞的空間結(jié)構(gòu)以及各種生理活動都具有重要作用。微管是由α-tubulin和β-tubulin形成的異二聚體組裝成的多聚體，其中有6種β微管蛋白同型體，而βIII-tubulin與抗微管類化療藥物敏感性有最密切的關(guān)系[6]。當可溶性微管蛋白水平增加后，β-tubulin mRNAs翻譯水平出現(xiàn)下調(diào)，機體通過自身調(diào)控機制調(diào)節(jié)β-tubulin同型體的表達[13,14]?？刮⒐艿鞍拙酆纤幬镉腥箢?，即秋水仙堿類、鬼臼素類和長春花生物堿類（如長春瑞濱）。而促進微管聚合、抑制微管蛋白解聚的藥物目前有紫杉醇和多西紫杉醇兩類[15]。

β-tubulin是抗微管類藥物的主要靶點，分析β-tubulin同型體的表達確定藥物耐藥有關(guān)的具體靶蛋白是非常有必要的。研究[16,17]表明βIII-tubulin高表達與作用于微管的藥物有關(guān)，而與其他β-tubulin亞型沒有交叉作用。

研究[18.19]表明βIII-tubulin低表達的NSCLC患者經(jīng)紫杉類化療其療效及預后均優(yōu)于高表達者。Vilmar等[9]的研究認為NSCLC中不同組織學類型其βIII-tubulin表達不同，腺癌的陽性表達率較鱗癌和其它組織學類型的陽性表達率高，βIII-tubulin-negative腺癌患者較βIII-tubulin-positive腺癌者PFS和OS延長（P＜0.05），且其OS較βIII-tubulinnegative鱗癌或大細胞癌患者延長（P＜0.05）。

許多臨床前研究[5,12,21]和臨床證據(jù)表明βIII-tubulin在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)上皮源性腫瘤包括NSCLC中βIII-tubulin表達異常與腫瘤分化能力、侵襲性密切相關(guān)，其高表達者表現(xiàn)為腫瘤低分化、惡性程度高、侵襲性增加等特點，且患者生存期短、預后差，故不僅是化療耐藥的標記物也是NSCLC的獨立預后因子[20]。

許多臨床研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者術(shù)后腫瘤組織中βIII-tubulin陽性表達組的OS短于陰性表達組，兩者有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），證明βIII-tubulin可作為NSCLC術(shù)后的一個獨立預后因子，βIII-tubulin高表達可能是肺癌的預后因子。Rosell等[18]和王峻等[12]的研究顯示在NSCLC腫瘤組織中βIII-tubulin高表達對長春堿類藥物敏感性低。Vilmar等[9]的研究認為βIII-tubulin-negative的晚期肺腺癌患者較βIII-tubulin-positive腺癌者PFS和OS延長（P＜0.05），并且化療后其OS較鱗癌或大細胞癌者延長（P＜0.05）。以上研究表明βIII-tubulin高表達的患者預后差，PFS和OS短，而且高表達者對化療耐藥，可能與腫瘤的進展有關(guān)。

本研究應用βIII-tubulin siRNA轉(zhuǎn)染A549/Taxol細胞，并檢測βIII-tubulin基因和蛋白水平的表達情況，并檢測靶基因下調(diào)后對紫杉醇的敏感性的變化以及細胞凋亡和細胞周期情況。

結(jié)果顯示βIII-tubulin siRNA組的靶基因表達明顯下調(diào)（87.73±4.87）%（P＜0.01）；βIII-tubulin siRNA組的靶蛋白表達較對照組明顯減少，與βIII-tubulin mRNA表達下調(diào)相一致；紫杉醇處理后βIII-tubulin siRNA組的細胞抑制率較control組明顯增加（51.77±4.60）%（P＜0.01），表明下調(diào)βIII-tubulin基因表達明顯增加對紫杉醇的敏感性。細胞早期凋亡率較對照組明顯增加（P＜0.01），且20 μg/mL時明顯（40.12±3.86）% vs （21.47±5.44）%，提示下調(diào)βIII-tubulin后紫杉醇誘導的細胞早期凋亡率增加，抑制腫瘤增殖；紫杉醇誘導后βIII-tubulin siRNA組G2/M期細胞百分率明顯高于未處理組（P＜0.05），將細胞阻滯在G2/M期，抑制腫瘤細胞增生，可能與促進細胞凋亡有關(guān)。且紫杉醇誘導轉(zhuǎn)染組細胞晚期凋亡率較對照組增加，差異無統(tǒng)計學差異，細胞早期凋亡率明顯增加。因此βIII-tubulin可能是在調(diào)節(jié)化療藥物反應方面的一個重要的生存反應因子。

Hasegawa等[22]利用反義寡核苷酸干擾A549/Taxol下調(diào)靶基因表達后細胞對紫杉醇的敏感性較對照組明顯增加（P＜0.05）。Gan等[16]利用siRNA干擾兩組肺癌細胞株NCI-H460和Calu-6，發(fā)現(xiàn)βIII-tubulin siRNA干擾細胞后I型、II型、IV型和總β-tubulin表達均較對照組無差異。而βIII-tubulin表達水平較對照組明顯減少。且兩組細胞對作用于微管的兩種化療藥物紫杉醇和長春新堿的藥物敏感性較對照組明顯增加。細胞凋亡率較對照組明顯增加。這與本研究結(jié)果相一致。證實了βIII-tubulin高表達對紫杉醇耐藥，相反低表達對紫杉醇敏感，通過增加細胞凋亡來抑制腫瘤增殖。

βIII-tubulin表達與紫杉醇敏感性有關(guān)，體內(nèi)和體外實驗已經(jīng)證實低表達者療效及預后均優(yōu)于高表達者，提示βIII-tubulin有可能作為預測紫杉醇敏感性的一個指標，有利于指導NSCLC的臨床個體化治療。