劉暢 徐東波 鐘殿勝

目前,全世界范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率和病死率居各類惡性腫瘤之首[1].大部分肺癌患者診斷時已是晚期而喪失了手術(shù)機(jī)會,也因此無法獲得手術(shù)標(biāo)本[2].約70%的肺癌患者是靠小的活檢標(biāo)本和/或細(xì)胞學(xué)切片標(biāo)本診斷的,并且這些小標(biāo)本是僅有的可用于突變檢測的材料[3,4].經(jīng)典的DNA直接測序法可檢測所有已知和未知突變,被稱為表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)突變檢測的"金標(biāo)準(zhǔn)",但其靈敏度較低,對樣本所含腫瘤細(xì)胞數(shù)量要求較高,僅能對含量大于30%的突變基因進(jìn)行檢測[5],當(dāng)其用于小標(biāo)本檢測時,會使其假陰性率大幅增加[4,5].因此,相當(dāng)一部分本可以從EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitor, EGFRTKI)獲益的患者仍不能被檢出.隨著介入影像學(xué)和微創(chuàng)活檢技術(shù)的進(jìn)展,如支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下經(jīng)支氣管針吸活檢術(shù)(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA),應(yīng)用小標(biāo)本進(jìn)行臨床病理檢測的趨勢勢必會延續(xù)[6].近些年來隨著分子水平技術(shù)的發(fā)展,涌現(xiàn)出一些檢測基因突變更為靈敏的方法,如應(yīng)用特異性探針的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(TaqMan PCR assay)、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)技術(shù)(amplified refractory mutation system, ARMS)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)、變性高效液相色譜分析(denaturing highperformance liquid chromatography, dHPLC)和高分辨率熔解曲線分析(high-resolution melting analysis, HRMA)等[7-10].但這些方法或因其價格昂貴,操作復(fù)雜,耗時長,對實驗環(huán)境、操作人員水平及設(shè)備要求高,尚未廣泛應(yīng)用于臨床.免疫組織化學(xué)染色法較分子水平的檢測手段價格低廉,操作簡便、迅速,可在幾乎所有病理實驗室開展.因此,對突變特異性抗體的免疫組化法應(yīng)用可作為分子水平檢測方法的一種輔助手段.

已有大量文獻(xiàn)及臨床資料[11,12]證實存在EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者對EGFR-TKIs的治療有良好反應(yīng),歐美地區(qū)NSCLC患者EGFR突變發(fā)生率約為10%-16%,亞裔NSCLC患者的EGFR突變發(fā)生率約為30%-50%.其突變主要發(fā)生在EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的編碼區(qū),即第18-21外顯子,其中發(fā)生在19外顯子的E746_A750缺失突變(屬于15-bp/5AA缺失)和21外顯子上的L858R點突變被稱為經(jīng)典型突變,約占EGFR突變的85%-90%[13,14].19外顯子缺失突變包含如9-bp、12-bp、15-bp、18-bp、24-bp缺失突變等,其中以15-bp缺失的E746_A750del突變最為常見,約占19外顯子缺失突變的68%,其余稍常見的少見型諸如18-bp缺失的L747_P753>S(6.7%),15-bp缺失的L747_T751del(6.4%),9-bp缺失的L747_E749del(6.4%)等[15].21外顯子突變中,L858R點突變?yōu)樽畛Ｒ姷念愋?約占所有EGFR突變的39%[16],其它少見型如L861Q突變等.除此之外,約有6%-10%為發(fā)生在18和20外顯子的突變[16].

2009年,Yu等[l7]在新西蘭大白兔體內(nèi)獲得了兩種單克隆抗體,即抗E746_A750缺失突變抗體和抗L858R點突變抗體,隨后他們搜集了340例原發(fā)性NSCLC患者,并用這兩種抗體測試上述腫瘤標(biāo)本,所得的免疫組化結(jié)果與DNA直接測序結(jié)果比較顯示靈敏度92%,特異度99%.近些年來,多項研究[4,15-24]應(yīng)用上述相同的兩種抗體進(jìn)一步檢測NSCLC患者EGFR突變情況,免疫組化結(jié)果示靈敏度范圍波動于24%-100%,特異度范圍波動于77%-100%(表1).在表1所列的11項有關(guān)免疫組化法檢測特異性EGFR突變的研究中,均表現(xiàn)出較高的特異度,其中9項的特異度可高達(dá)96%及以上;但靈敏度浮動范圍較大,最低僅有24%.回顧上述文獻(xiàn),分析影響免疫組化結(jié)果的原因,主要可能與免疫組化過程中抗原修復(fù)液的不同、免疫組化結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)不同、是否加做總EGFR抗體檢測等有關(guān).下文將對上述主要影響因素做詳細(xì)闡述.

1 抗原修復(fù)液的不同對免疫組化染色結(jié)果的影響

抗原修復(fù)是免疫組化染色中的重要步驟之一,通常用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片,由于組織中的部分抗原在甲醛固定過程中發(fā)生了蛋白之間的交聯(lián),加之醛基的封閉作用,從而使抗原決定簇暴露不完善.此時則需抗原修復(fù)液,使抗原決定簇充分暴露,以利抗原抗體結(jié)合,提高檢測的陽性率[25].

北京大學(xué)第一醫(yī)院的熊焰等[24]在2013年研究免疫組化法檢測EGFR突變的實驗中,選取了三種不同的抗原修復(fù)液:檸檬酸鈉溶液(pH 6.0)、EDTA(pH 8.0)和EDTA(pH 9.0),分別用于50例經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的肺腺癌組織切片免疫組化染色過程中.染色結(jié)果示:EDTA(pH 8.0)處理過的組織切片顯色最佳,即特異性染色強(qiáng),背景色最淺;檸檬酸鈉(pH 6.0)組陽性細(xì)胞染色太淺以致很難將其識別出;EDTA(pH 9.0)組背景染色太強(qiáng)以致難以區(qū)分出腫瘤細(xì)胞染色.讀片病理醫(yī)師間的一致度在EDTA(pH 8.0)組最高,檸檬酸鈉(pH 6.0)組次之,EDTA(pH 9.0)組最低,并且其差異有統(tǒng)計學(xué)意義.究其理論依據(jù):抗原在不同pH值環(huán)境中,等電點會發(fā)生改變,抗原抗體表面電荷的改變影響二者結(jié)合,造成在不同pH值的抗原修復(fù)液中染色強(qiáng)度不同[25].

2 免疫組化染色結(jié)果的不同評判標(biāo)準(zhǔn)

目前對于免疫組化法的特異性染色結(jié)果尚無統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn),由于評分方法紛繁眾多,尚缺乏大宗實驗驗證所有方法中哪種方法最優(yōu),但大部分方法都是以陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度相結(jié)合的方式評判[4,15-24].陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)有僅基于胞膜染色的[15,19,23],也有基于胞膜和/或胞漿染色的[4,17,18,22].應(yīng)用較多的是Yu等[17],在大白兔體內(nèi)獲得兩種特異性抗體之后,行特異性免疫組化染色所用標(biāo)準(zhǔn).其將結(jié)果分為0-3+四個等級,以腫瘤細(xì)胞的胞膜和/或胞漿染色為基準(zhǔn),0為腫瘤細(xì)胞無染色或<10%的腫瘤細(xì)胞淺染;1+為>10%的腫瘤細(xì)胞淺染;2+為腫瘤細(xì)胞中度染色;3+為腫瘤細(xì)胞強(qiáng)染.1+-3+為陽性,0為陰性[17].此后,Simonettis[18]、Hofman等[22]也應(yīng)用同樣方法判讀結(jié)果,與分子水平的檢測手段相比,均表現(xiàn)出較高的特異度,但靈敏度變化范圍較大,低至24%,高至93%,考慮其差異還可能來源于評判標(biāo)準(zhǔn)以外的因素:比如所選樣本中突變樣本所占比例不同(所含突變樣本越多,被檢出突變的概率越高);除最常見的19外顯子的E746_A750缺失突變和21外顯子的L858R點突變外,其它少見型突變由于不能與上述兩種特異性抗體反應(yīng)進(jìn)而不能被檢出.

表 1 免疫組化法檢測EGFR突變靈敏度及特異度的文獻(xiàn)回顧("/"表示相關(guān)數(shù)據(jù)缺少)Tab 1 Sensitivity and specificity of immunohistochemical detections of EGFR mutations in eleven studies ("/ " indicates that data are not available)

2013年,熊等[23]針對特異性抗體檢測EGFR突變的免疫組化染色,以DNA直接測序法為金標(biāo)準(zhǔn),比較了三種評判標(biāo)準(zhǔn)各自的可靠程度.A法[26]以>10%的腫瘤細(xì)胞胞膜和/或胞漿中到強(qiáng)度染色為陽性;B法[19]以>10%的腫瘤細(xì)胞胞膜任意強(qiáng)度染色為陽性;C法[21]以>50%的腫瘤細(xì)胞胞膜和/或胞漿任意強(qiáng)度染色染色為陽性.結(jié)果示A法最為理想,應(yīng)用此法可檢測出E746_A750缺失突變和L858R點突變的特異度分別為100%和97%,靈敏度分別為59%和81%.從可靠程度來講,對于L858R突變的檢測,A法較B、C法有統(tǒng)計學(xué)差異;但對E746_A750缺失突變的檢測,A法較B、C法無統(tǒng)計學(xué)差異[23].總結(jié)A、B、C法,我們可以推出強(qiáng)調(diào)腫瘤細(xì)胞胞膜和/或胞漿染色的方法(A法)優(yōu)于僅強(qiáng)調(diào)腫瘤細(xì)胞胞膜染色的方法(B法),同時也優(yōu)于僅考慮染色區(qū)域而忽略染色強(qiáng)度的方法(C法).除此之外,還有將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比相乘的方法,以結(jié)果大于某一界定數(shù)值為陽性,小于該數(shù)值為陰性,如Colorado大學(xué)的免疫組化H評分法[16]和Kozu等[21]所使用的方法.

縱觀上述文獻(xiàn),考慮免疫組化法檢測EGFR特異性突變的特異度高,則誤診率較低;但靈敏度浮動范圍較大,最低僅有24%,則提示其假陰性率較高,會有較多實際為EGFR突變的病例漏診,此時則需借助其他靈敏度較高的分子水平手段進(jìn)一步檢測已明確是否存在EGFR突變.2013年,蔣等[4]針對免疫組化法檢測EGFR特異性突變結(jié)果的特點,制定了一套EGFR突變篩查流程圖.其收集了399例NSCLC患者的標(biāo)本(包括145例手術(shù)標(biāo)本,220例活檢小標(biāo)本和34例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本),應(yīng)用特異性抗體對上述標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色(對于活檢小標(biāo)本或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本,僅當(dāng)腫瘤細(xì)胞數(shù)超過5個時才評價其免疫組化染色結(jié)果),并將染色結(jié)果分為0-3+四個等級,標(biāo)準(zhǔn)為:0:無染色;1+:腫瘤細(xì)胞淺黃染不伴明顯顆?；虿怀^10%的腫瘤細(xì)胞黃染伴明顯顆粒;2+:超過10%的腫瘤細(xì)胞黃染伴明顯顆粒或不超過10%的腫瘤細(xì)胞棕染伴明顯顆粒;3+:超過10%的腫瘤細(xì)胞棕染伴明顯顆粒.另外應(yīng)用TaqMan PCR法(較DNA直接測序靈敏度更高)作為金標(biāo)準(zhǔn),檢測每份標(biāo)本各自EGFR突變情況.當(dāng)以0和1+為陰性,2+和3+為陽性時,免疫組化法和TaqMan PCR法結(jié)果的一致度是最高的(κ=0.644),然而在1+的評分里仍會有24例(24/104, 23.08%)為假陰性病例,在2+的評分里仍有33例(33/103, 32.04%)為假陽性病例,致免疫組化法的靈敏度為77.63%,特異度為86.64%,因此簡單用此結(jié)果指導(dǎo)臨床是不理想的.但在免疫組化染色評分為3+的標(biāo)本中,特異度和陽性預(yù)測值均可達(dá)100%;免疫組化染色為評分為0的標(biāo)本中,陰性預(yù)測值可達(dá)93.06%,加做總EGFR抗體(D38B1,非突變特異性抗體,可檢測出所有EGFR蛋白表達(dá)無論其突變與否)檢測,陰性預(yù)測值可高達(dá)97.22%.蔣等[4]根據(jù)上述結(jié)果的特點,制定的EGFR突變篩查流程為:若IHC染色結(jié)果評分為3+,可不行其他分子水平的檢測,直接接受EGFR-TKI治療;若評分為0,加做總EGFR抗體的免疫組化染色,篩查出的結(jié)果可達(dá)97%的陰性預(yù)測;當(dāng)評分為1+或2+時,由于結(jié)果不可靠,需進(jìn)一步接受分子水平的檢測手段以明確是否存在EGFR突變.相比Yu等[17]對2+(中度染色)及3+(強(qiáng)染)級別僅設(shè)定籠統(tǒng)強(qiáng)度指標(biāo)的方法,蔣等[4]對這兩個級別進(jìn)行了更為具體的百分比劃分,因此考慮后者在指導(dǎo)病理醫(yī)師對染色結(jié)果評分方面更為客觀、嚴(yán)謹(jǐn).另外蔣等[4]對不同類型的標(biāo)本進(jìn)行分析,推斷免疫組化法用于手術(shù)切除標(biāo)本優(yōu)于活檢小標(biāo)本,活檢小標(biāo)本優(yōu)于體液來源的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本.

目前大多數(shù)實驗研究認(rèn)為基于腫瘤細(xì)胞胞膜和/或胞漿的染色強(qiáng)度與染色區(qū)域的百分比設(shè)定的評分標(biāo)準(zhǔn),并按程度分為0-3+四個等級,是所有評分系統(tǒng)中最佳的方法[4,15,17,22,24].盡管不同研究者實驗所得免疫組化法檢測突變靈敏度的結(jié)果波動范圍較大且大多不甚理想,但這并不能成為限制其臨床應(yīng)用的障礙,根據(jù)蔣等[4]提出的流程圖,當(dāng)免疫組化法不能明確是否存在EGFR突變時,應(yīng)進(jìn)一步行靈敏度更高的分子水平檢測手段驗證.設(shè)置嚴(yán)格的免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)可減少假陽性率,以避免患者因誤診予以TKI藥物治療而帶來的損失.

3 加做EGFR單克隆抗體(D38B1)檢測對免疫組化結(jié)果的影響

與突變特異性抗體不同的是,EGFR單克隆抗體(D38B1)可識別所有EGFR蛋白表達(dá)無論是否存在EGFR基因突變[4].應(yīng)用D38B1抗體檢測出總EGFR表達(dá)為陰性的腫瘤標(biāo)本,也不應(yīng)被檢測出特異性EGFR突變[19].反之,特異性突變蛋白的表達(dá)水平受總EGFR表達(dá)水平影響,若腫瘤細(xì)胞內(nèi)總EGFR表達(dá)水平很低,即便該樣本的腫瘤細(xì)胞的確存在特異性EGFR基因突變,應(yīng)用該特異性抗體行免疫組化染色的結(jié)果也可能為陰性,因此應(yīng)用EGFR單克隆抗體(D38B1)檢測總EGFR表達(dá)水平可減少特異性突變假陰性結(jié)果的產(chǎn)生,提高檢測的靈敏度[4,19,20].2011年Wu等[20]首次提出,加做總EGFR抗體(D38B1)檢測并將其納入對免疫組化結(jié)果的解釋中可增加EGFR突變檢測的可靠性,尤其對于21外顯子的L858R點突變.其結(jié)論為,根據(jù)邏輯回歸分析模型得出的最佳曲線下面積(area under the curve,AUC),對于L858R的檢測,綜合L858R的Q評分(Q=強(qiáng)度X百分比)與總EGFR表達(dá)的Q評分得出的結(jié)果最佳,且與僅以L858R染色強(qiáng)度為評分標(biāo)準(zhǔn)的方法相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(0.891 vs 0.853, P=0.036).對于E746_A750缺失的檢測,曲線下面積最優(yōu)的方法為綜合E746_A750缺失表達(dá)Q評分與總EGFR表達(dá)染色強(qiáng)度,但與僅以E746_A750表達(dá)強(qiáng)度為評分標(biāo)準(zhǔn)的方法相比,不具有統(tǒng)計學(xué)差異(0.969 vs 0.958, P=0.087)[20].另外,Wu等[20]將免疫組化結(jié)果與患者臨床服用靶向藥物療效相結(jié)合發(fā)現(xiàn),上述免疫組化法陽性組的患者對EGFR-TKI治療的反應(yīng)及無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)均強(qiáng)于陰性組的患者.后來,蔣等[4]也發(fā)現(xiàn),加做總EGFR抗體的免疫組化染色可以將E746_A750缺失突變和L858R點突變檢出的靈敏度分別提高到82.56%和90%[4].

4 其他

影響免疫組化結(jié)果可靠程度的因素有很多,然而其最終的可靠性取決于整個過程的質(zhì)量控制,包括抗體的公司來源、免疫組化方法的選擇、評分系統(tǒng)的選擇、對結(jié)果的解釋及是否能與分子水平檢測方法的恰當(dāng)結(jié)合等等[2,24].

5 小結(jié)

對于最常見的兩種EGFR突變類型的檢測,應(yīng)用特異性抗體的免疫組化法具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、易于在眾多病理實驗室開展、可以保留形態(tài)學(xué)資料等特點,這些是其較目前新興的分子水平檢測手段最為明顯的優(yōu)勢.另外,與經(jīng)典的DNA直接測序相比,其更適于DNA含量較少的小標(biāo)本檢測,如在Kitamura[19]的實驗中就曾發(fā)現(xiàn)一例EGFR基因檢測為野生型,但免疫組化法結(jié)果陽性且對酪氨酸激酶抑制劑治療反應(yīng)良好的病例.因此不排除在那些與DNA直接測序法相比,免疫組化結(jié)果為"假陽性"的病例中,實際對酪氨酸激酶抑制劑治療反應(yīng)良好的病例,此時需借助靈敏度更高的分子水平檢測進(jìn)一步驗證.合理應(yīng)用特異性抗體的免疫組化法篩查EGFR突變具有實際臨床意義,但要嚴(yán)格保證整個過程的質(zhì)量控制,選擇合理的試劑、制定恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)、檢測總EGFR表達(dá)水平等等.未來仍需大宗臨床資料驗證免疫組化法診斷陽性的患者,其靶向藥物治療反應(yīng).