鄭永紅，陳群，朱德曉，張世袍

血漿同型半胱胺酸水平和5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與原發(fā)性下肢深靜脈血栓形成的相關(guān)性研究

鄭永紅，陳群，朱德曉，張世袍

目的：探討血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平及5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因多態(tài)性與原發(fā)性下肢深靜脈血栓形成的關(guān)系。

方法:選擇原發(fā)性下肢深靜脈血栓患者220例（病例組）和同期對照者240例（對照組），收集年齡、性別和體重等臨床資料，測定空腹血糖、血清總膽固醇、纖維蛋白原和D二聚體等生化指標，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿Hcy水平，并應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性方法進行MTHFR C677T基因多態(tài)性的分析。兩組年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、空腹血糖和血清總膽固醇差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），病例組纖維蛋白原、D-二聚體和血漿Hcy值高于對照組（P＜0.05）。

結(jié)果: MTHFR TT 基因型在病例組的分布頻率為16.8%高于對照組6.7%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。病例組CT基因型、TT基因型與CC 基因型相比血漿Hcy 水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而在對照組中只有TT基因型與高于CC 基因型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。無論是CC基因型、CT基因型或TT基因型，病例組的血漿 Hcy 水平均高于對照組（P＜0.05）。

結(jié)論:血漿高Hcy水平是原發(fā)性下肢深靜脈血栓形成的危險因素。MTHFR C677T基因多態(tài)性中TT 基因型可能是原發(fā)性下肢深靜脈血栓形成的一個重要風險遺傳因子。

下肢深靜脈血栓形成；同型半胱胺酸；5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:209.)

同型半胱氨酸( Hcy )是一種含巰基的氨基酸,是蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物。在Hcy代謝過程中，5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是其代謝途徑中的關(guān)鍵酶，MTHFR 基因第677位C→T 突變（MTHFR C677T）可以導致血漿Hcy的水平改變[1]。近來研究表明，高同型半胱氨酸血癥是中國人的心血管疾病的獨立危險因素[2、3]。MTHFR 基因多態(tài)性也與心腦血管[4]和外周血管疾病[5]密切相關(guān)，但MTHFR基因是否完全通過影響Hcy的水平起作用至今機制未明[6]。大多數(shù)學者認為輕、中度升高的血漿同型半胱氨酸水平與深靜脈血栓成正相關(guān)。然而對于MTHFR基因多態(tài)性與靜脈血栓的關(guān)系，國內(nèi)外文獻報道結(jié)論不一。目前國內(nèi)對于原發(fā)性深靜脈血栓與Hcy及MTHFR C677T 基因相關(guān)性的系統(tǒng)研究尚少。本研究目的旨在探討血漿Hcy水平及MTHFR C677T 基因多態(tài)性與中國南方漢族人原發(fā)性下肢深靜脈血栓的關(guān)系，進一步了解原發(fā)性深靜脈血栓形成的主要危險因素。

1 資料與方法

實驗對象：病例組：2008-07至2012-06因原發(fā)性下肢深靜脈血栓入住福建省立醫(yī)院的患者220例，其中男114例，女106例，年齡42～78歲，平均(67±13)歲，均為福建漢族人。納入標準：根據(jù)2008年中華醫(yī)學會血管外科分會制定的深靜脈血栓診治指南，并且經(jīng)下肢深靜脈血管造影檢查證實靜脈血栓存在，排除嚴重心腦血管及肝腎疾病、惡性腫瘤、骨折、近期手術(shù)、妊娠、長期激素治療等繼發(fā)性因素所致的血栓形成，以及近一周內(nèi)應用抗凝藥及其他部位血栓病史者。對照組：選取同期在我院體檢中心年齡、性別和體重構(gòu)成相匹配的健康體檢者240例，其中男127例，女113例，年齡40～76歲，平均(66±15)歲。測定病例組及對照組體質(zhì)指數(shù)、空腹血膽固醇、空腹血糖、纖維蛋白原及D二聚體，并采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）于酶聯(lián)儀測定血漿Hcy 水平（Hcy試劑盒購自浙江大學生科生物技術(shù)有限公司）[7]。兩組研究對象在年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)指數(shù)、血膽固醇和空腹血糖值上差異均無統(tǒng)計學意義，血纖維蛋白原、D-二聚體和血漿Hcy值在病例組顯著高于對照組（P＜0.05）。（表1）

表1 兩組基本臨床資料比較（±s）

表1 兩組基本臨床資料比較（±s）

注：與對照組比較 *P＜0.05

項目 對照組(n=240) 病例組(n=220)年齡 (歲) 65.6±15.3 67.3±12.6性別(男/女 ) 127/113 114/106體質(zhì)指數(shù) (kg/m2) 21.8±3.6 23.1±3.8空腹血膽固醇 (mmol/L) 4.89±0.8 4.72±1.1空腹血糖 (mmol/L) 4.85±0.8 5.04±0.9纖維蛋白原 (mmol/L) 3.24±0.9 3.76±1.4 *D-二聚體(mmol/L) 0.35±0.3 15.5±0.7 *同型半胱胺酸 (μ mol/L) 10.15±4.6 14.98±7.0*

基因型檢測：脫氧核糖核酸（DNA）提取試劑盒提取各組外周靜脈血白細胞DNA，并用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)法檢測基因型。MTHFR基因型上游引物：5’-GTGTGGGAGCTTGGAGCAAT-3’,下游引物：5’-GAAAAGCTGCGTGATGATGA-3’。 聚 合 酶 鏈反應反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共38個循環(huán)，最后72℃延伸8 min。取PCR產(chǎn)物，3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像，并經(jīng)基因測序明確基因型。

統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析。用直接計數(shù)法計算各組病例和對照組的性別、基因型及等位基因頻率。組間基因型及等位基因頻率用卡方檢驗。均數(shù)組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

基因多態(tài)性分析：MTHFR基因的聚合酶鏈反應產(chǎn)物為369 bp，可被酶切產(chǎn)生193 bp、112 bp、64 bp三個片段。位于第677位堿基存在C-T突變，當?shù)?77位堿基突變?yōu)門時，193 bp片段可進一步被酶切成165 bp和28 bp。28 bp太小，易跑出瓊脂糖。故存在193 bp、112 bp、64 bp條帶為CC型，存在165 bp、112 bp、64 bp條帶則為TT型，193 bp、165 bp、112 bp、64 bp四個條帶同時存在則為CT型（圖1）。兩組人群基因型分布經(jīng)卡方檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡，因此具有人群代表性。MTHFR TT 基因型在病例組的分布頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。TT 基因型與下肢深靜脈血栓顯著相關(guān)（比值比：2.77，P＜0.05）。

表2 兩組不同5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因型分布頻率比較 [例（%）]

不同 MTHFR 基因型血漿Hcy 水平的比較 ：無論是CC基因型、CT基因型或TT基因型，病例組的血漿Hcy 水平均高于對照組（P＜0.05）。病例組CT基因型、TT基因型與本組CC 基因型相比血漿Hcy水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而在對照組中只有TT基因型與高于本組CC 基因型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表 3）

表3 兩組不同5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因型血漿同型半胱氨酸水平比較 （μ mol/L±s)

表3 兩組不同5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因型血漿同型半胱氨酸水平比較 （μ mol/L±s)

注：與對照組比較 *P＜0.05；與本組CC基因型比較 △P＜0.05。余注見表2

MTHFR基因型 對照組(n=240) 病例組(n=220)CC 9.08±4.7 12.08±6.9*CT 11.31±4.5 17.16±7.6*△TT 14.15±3.5△ 19.02±5.3 *△

3 討論

下肢深靜脈血栓形成是一種發(fā)病率很高的周圍血管疾病，近年來在我國有一個較快上升的勢頭。原發(fā)性深靜脈血栓形成是排除繼發(fā)因素的原發(fā)性血栓性疾病，主要與遺傳和環(huán)境相關(guān)。Hcy可導致血管內(nèi)皮損傷、血栓形成，是血液高凝狀態(tài)形成的重要原因之一。Gatt等[8]認為高Hcy是靜脈血栓性疾病的獨立危險因素。本組研究結(jié)果顯示，病例組Hcy 水平明顯高于對照組，證實了Hcy與原發(fā)性深靜脈血栓形成關(guān)系密切，高Hcy是原發(fā)性血栓性疾病的一個重要的危險因子。

血中Hcy水平升高主要受遺傳和營養(yǎng)因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因的突變是引起Hcy改變的主要遺傳因素，兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系[9]，它的多態(tài)性可以通過影響酶的活性而影響血漿Hcy水平。另有學者認為它也可通過MTHFR酶直接影響內(nèi)皮的功能，從而是心血管疾病的獨立的影響因子，而不依賴于高Hcy產(chǎn)生效用[6]。目前國內(nèi)外關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性與靜脈血栓栓塞癥的相關(guān)性文獻報道結(jié)論不一，甚至相反。于海東等[10]和Yin等[11]報道MTHFR的TT基因型在靜脈血栓組的分布頻率高于對照組, MTHFR C677T多態(tài)性中TT基因型可能是深靜脈血栓形成的一個遺傳風險因子。但有些學者認為MTHFR基因C677T突變并不是靜脈血栓栓塞癥的獨立危險因子[12、13]。造成結(jié)論不一的原因，考慮可能與MTHFR C677T的種族、地域分布差異有關(guān)，也可能與樣本量及實驗設計有關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)TT基因型在原發(fā)性深靜脈血栓的分布頻率高于對照組。進一步研究表明，中國南方漢族人中，無論是CC 基因型、CT 基因型或TT 基因型，病例組的Hcy水平均明顯高于對照組，提示了高Hcy血癥可能是導致下肢深靜脈血栓發(fā)病的重要因素之一。在病例組中CT 基因型與CC 基因型相比、TT 基因型與CC基因型相比Hcy 水平均升高，差異有顯著意義，而在對照組中只有TT 基因型與CC 基因型相比較差異有統(tǒng)計學意義，這提示TT 基因型突變與高Hcy血癥有著密切關(guān)系。目前國內(nèi)外更多的研究靜脈血栓栓塞癥與上述兩者的關(guān)系中包含許多繼發(fā)性因素如：骨折手術(shù)與制動、癱瘓或長期臥床、長期使用雌激素、惡性腫瘤、妊娠、口服避孕藥和心腦血管及肝腎疾病等，都對研究造成一定影響。而我們的研究選擇的人群為單純的原發(fā)性下肢深靜脈血栓的患者，且均經(jīng)下肢靜脈造影明確診斷，排除了許多繼發(fā)性的因素的干擾，同時校正了高膽固醇和高血糖兩個可能影響結(jié)果的因素。我們推測，MTHFR基因通過第677位C→T突變引起血漿Hcy水平增高，從而參與下肢深靜脈血栓的發(fā)病過程，我們認為MTHFR TT基因型突變可能是引起下肢深靜脈血栓患者高Hcy 血癥的重要遺傳因素，這與凱麗比努爾[14]的看法一致，即TT基因型仍然主要通過影響Hcy的水平來影響血栓的形成。而與凱麗比努爾看法不同之處在于我們認為MTHFR基因C677T多態(tài)性可能是下肢深靜脈血栓形成的一個獨立的重要的遺傳風險因子。

原發(fā)性下肢深靜脈血栓發(fā)病是多因素參與的病理過程，也許將來可以通過篩查MTHFR 基因來預測部分人群的靜脈血栓形成。當然目前尚待大規(guī)模的臨床數(shù)據(jù)來證實這一方法的可行性。由此通過提高這類疾病的診治水平，從而改善其預后。

[1]許海燕, 陳在嘉, 湯建, 等. 單種或多種基因突變對血漿同型半胱胺酸的影響. 中國循環(huán)雜志, 2000, 15: 83-84.

[2]Ho CH, Kuo BI, Kong CW, et al. Influence of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism, B vitamins and other factors on plasma homocysteine and risk of thromboembolic disease in Chinese. J Chin Med Assoc, 2005, 68: 560-565.

[3]劉佳, 徐援, 高霞, 等. 高同型半胱氨酸血癥對原發(fā)性高血壓患者冠狀動脈內(nèi)皮功能的影響. 中國循環(huán)雜志, 2013, 28: 576-580.

[4]尹春琳, 徐東, 魏嘉平, 等. 急性冠狀動脈綜合征患者同型半胱氨酸與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性及其與冠心病其它危險因素的相關(guān)分析. 中國循環(huán)雜志, 2013, 28: 254-257.

[5]Khandanpour N, Willis G, Meyer FJ, et al. Peripheral arterial disease and methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T mutations: A casecontrol study and meta-analysis. J Vasc Surg, 2009 , 49: 711-718.

[6]Marosi K, Agota A, Végh V, et al. The role of homocysteine and methylenetetrahydrofolate reductase, methionine synthase,methionine synthase reductase polymorphisms in the development of cardiovascular diseases and hypertension. Orv Hetil, 2012, 153: 445-453.

[7]李俊玲, 于天義. 血漿同型半胱氨酸檢測方法及臨床應用進展. 醫(yī)學檢驗與臨床, 2009, 20: 78-79.

[8]Gatt A, Makris M, Gatt A, et al. Hyperhomocysteinemia and venous thrombosis. Semin Hematol, 2007, 44: 70-76.

[9]Mandala E, Lafaras C, Tsioni C, et al. Prevalence of thrombophilic mutations in patients with unprovoked thromboembolic disease.A comparative analysis regarding arterial and venous disease.Hippokratia, 2012, 16: 250-255.

[10]于海東, 鄭紅, 齊華, 等. 同型半胱氨酸代謝酶基因多態(tài)性與深靜脈血栓的相關(guān)性研究. 中華醫(yī)學遺傳學雜志, 2006, 23: 635-639.

[11]Yin G, Yan L, Zhang Z, et al. C677T methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism as a risk factor involved in venous thromboembolism: a population-based case-control study. Mol Med Rep, 2012, 6: 1271-1275.

[12]Joachim E, Goldenberg NA, Bernard TJ, et al. The methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism (MTHFR c.677C＞T) and elevated plasma homocysteine levels in a U. S. pediatric population with incident thromboembolism. Thromb Res, 2013, 132:170-174.

[13]Ray JG, Shmorgun D, Chan WS, et al. Common C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reductase gene and the risk of venous thromboembolism: meta-analysis of 31 studies. Pathophysiol Haemost Thromb, 2002, 32: 51-58.

[14]凱麗比努爾·阿布都熱合曼，艾力曼·馬合木提，夏玉寧, 等. 維吾爾族亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性及血漿同型半胱胺酸水平與靜脈血栓栓塞癥的相關(guān)性. 中華心血管病雜志, 2012, 40:1030-1036.

Relationship Between Homocysteine Level, 5, 10-Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Polymorphism With Primary Lower Extremity Deep Venous Thrombosis Formation

ZHENG Yong-hong, CHEN Qun, ZHU De-xiao, ZHANG Shi-pao.
Department of Cardiology, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou (350001), Fujian, China

ZHENG Yong-hong, Email: zhengyongh@21cn.com

Objective: To explore the relationship between homocysteine (Hcy) level, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene polymorphism with primary lower extremity deep venous thrombosis (LEDVT) formation.

Methods: Our research included 2 groups, LEDVT group, n=220 patients and Control group, n=240 healthy subjects with the matched age, gender and body weight. The fasting blood glucose (GLU), total cholesterol (TC), fi brinogen (Fng)and D-dimer were determined, plasma Hcy level was measured by ELISA, MTHFR polymorphisms were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in both groups.

Results: The age, gender, BMI, GLU and TC levels were similar between 2 groups, P>0.05 and the Fng, D-dimer and Hcy levels were higher in LEDVT group than those in Control group, P<0.05. The distribution frequency of MTHFR TT genotype was higher in LEDVT group than Control group, 16.8% vs 6.7%, P<0.05. The patients with genotypes of CT, TT and CC in LEDVT group had the higher Hcy level than those in Control group, P<0.05. While in Control group,the TT genotype had the higher Hcy level than that in CC genotype, P<0.05.

Conclusion: Increased plasma Hcy level was the risk factor for LEDVT formation and the TT polymorphism of MTHFR might be one of the important genetic risk factors.

book=3,ebook=91

Lower extremity deep venous thrombosis formation; Homocysteine; 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase

350001 福建省福州市，福建省立醫(yī)院 心血管內(nèi)科(鄭永紅、陳群）；泉州市一醫(yī)院 心血管內(nèi)科（朱德曉）； 三明市第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科（張世袍）

鄭永紅 副主任醫(yī)師 碩士 主要從事心血管疾病的臨床診斷治療和研究 Email: zhengyongh@21cn.com 通訊作者：鄭永紅

R54

A

1000-3614（2014）03-0209-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.03.013

2013-10-25）

（編輯：王寶茹）