楊 會 郭遠(yuǎn)瑾

(荊門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 荊門 448000)

單純皰疹病毒(HSV)性腦炎(HSE)是成年人中最常見的非流行性、散發(fā)性病毒性腦炎〔1〕，主要由HSV-1型病毒引起，約占HSE患者總數(shù)的94%～96%，HSV-2型病毒主要感染新生兒及兒童。HSE的年發(fā)病率約為(2～3)/10萬，自然死亡率高達(dá)60%～80%，經(jīng)過有效抗病毒治療的患者，死亡率仍有20%，同時大多數(shù)存活者留有后遺癥〔2〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1和Toll樣受體(TLR)4在HSE鼠腦中的表達(dá)量明顯升高，提示其在HSE的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用〔1,2〕。甘草皂苷(Glycyrrhizin)是HMGB1特異性抑制劑，本文探討Glycyrrhizin對HSE小鼠HMGB1和TLR4水平的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物和病毒液 雄性ICR小鼠，10～16 g，南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，病毒液為HSV-IF株，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院提供，將HSV-IF株在人用狂犬病純化疫苗(VERO)細(xì)胞中培養(yǎng)48 h，當(dāng)有50%的VERO細(xì)胞變大、變圓或融合性病變時，收集病毒測定該病毒滴度為半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)10-5，選擇TCID5010-4濃度接種小鼠。

1.2動物分組和模型制作 將小鼠隨機分為假手術(shù)組、溶劑組、Glycyrrhizin組各20只。模型制作：采用顱內(nèi)注射法，用微量注射器抽取30 μl病毒懸液接種小鼠，注射部位在小鼠右眼外毗和外耳根連線的中點處垂直進針3 mm，穿過顱骨后有落空感時緩慢推入病毒液，拔出針頭，以骨蠟封閉顱骨針孔以防病毒懸液外溢。假手術(shù)組給予等量生理鹽水注射。造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：小鼠出現(xiàn)體重下降、毛發(fā)紊亂、激惹及抽搐發(fā)作等，剔除造模失敗的小鼠。注射病毒后1 h，Glycyrrhizin組腹腔注射0.5 ml Glycyrrhizin (Sigma公司；50 mg/kg)〔3〕，溶劑組僅腹腔注射等量生理鹽水。

1.3標(biāo)本 在小鼠接種病毒后第6天麻醉后處死，經(jīng)左心尖注射生理鹽水(30 ml)灌注后斷頭取腦，剖取右側(cè)顳葉組織并置-80℃保存。

1.4Western印跡法檢測 取100 mg腦組織，加入1 ml組織蛋白提取試劑(碧云天)，根據(jù)說明書步驟進行細(xì)胞總蛋白的提取，二辛可酸(BCA)法蛋白定量，取蛋白樣品50 μg，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，β-actin、TLR4和HMGB1抗體用5%牛奶稀釋(1∶200)，4℃過夜，洗滌緩沖液(TBST)洗膜，5%的牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊二抗，洗膜后，按照發(fā)光底物(ECL)說明書，1∶1配置發(fā)光工作液，凝膠成像儀成像，Image J軟件進行灰度分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進行t和χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)及死亡率 溶劑組和Glycyrrhizin組接種后陸續(xù)出現(xiàn)進食減少、體重不增、毛發(fā)蓬松、倦怠少動、步態(tài)不穩(wěn)或爬行、抽搐等，3～6 d時癥狀最明顯。 6 d內(nèi)溶劑組死亡率65%，Glycyrrhizin組死亡率30%，兩組死亡率有顯著差異(χ2=19.56,P<0.05)。

2.2HMGB1和TLR4的蛋白表達(dá)量 與假手術(shù)組相比，溶劑組HMGB1和TLR4表達(dá)量明顯升高；Glycyrrhizin組較溶劑組顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 Western印跡檢測HMGB1和TLR4的結(jié)果

表1 各組HMGB1和TLR4的灰度分析±s)

3 討 論

HMGB1是一種重要的促炎因子，它是一種在真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的核內(nèi)非組蛋白，主要發(fā)揮穩(wěn)定核小體的作用，是DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及修復(fù)的重要參與者，其在人體內(nèi)多種器官細(xì)胞中均有表達(dá)，在胞核和胞質(zhì)中均有分布〔4〕。當(dāng)機體遭受病毒感染時，大量組織細(xì)胞損傷或者壞死，HMGB1從受損的細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)直至胞外，這對于后續(xù)介導(dǎo)的免疫損傷具有重要意義：一方面，可以直接對細(xì)胞及組織產(chǎn)生損傷作用，另外一方面在與晚期糖化終末產(chǎn)物受體(RAGE)和TLR4結(jié)合后通過活化免疫細(xì)胞，使其殺傷靶細(xì)胞，清除外來物質(zhì)或者通過分泌炎性因子產(chǎn)生組織損傷作用。TLR4作為HMGB1的重要配體，它是固有免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，HMGB1與TLR4激活后，通過活化核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB，使炎性細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)〔5〕。

研究表明HSE的發(fā)生不僅與病毒復(fù)制有直接作用，而且與病毒誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)有密切關(guān)系〔6〕。HSE時發(fā)生的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞聚集及下游的炎性因子釋放在病理損害中發(fā)揮重要作用，減少炎癥因子的產(chǎn)生可以減輕HSE感染對機體造成的損害，HMGB1和TLR4在HSE動物模型中的表達(dá)升高〔7～9〕，但是其具體作用目前尚未有明確報道，Glycyrrhizin是HMGB1的特異性抑制劑，可以抑制HMGB表達(dá)發(fā)揮抗炎和抗損害作用〔10〕。研究〔11〕發(fā)現(xiàn)HSE感染后病變最嚴(yán)重的部位是顳葉，以出血壞死性病灶為特征，本實驗表明Glycyrrhizin可以降低小鼠死亡率，其可能機制與抑制鼠腦中HMGB1和TLR4表達(dá)相關(guān)。

4 參考文獻

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