袁 兵 湯 琦 張?jiān)戚x 許建彪 廖 鳳 譚 燕 黃云超

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650118)

目前肺癌的死亡率居各種惡性腫瘤之首〔1〕，由于大多數(shù)患者診斷時(shí)腫瘤出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，血管生成是實(shí)體腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移的必要條件，研究肺癌血管生成對肺癌的防治尤為重要。而結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(MACC1)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，MACC1基因的表達(dá)改變不僅在腸癌，而且可能包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)〔2～6〕，MACC1作為肝細(xì)胞生長因子(HGF) /c-met信號通路中的重要調(diào)節(jié)因子，能夠上調(diào)c-met的表達(dá)〔2〕，既往研究顯示c-met能夠調(diào)節(jié)MAPK、STAT和PI3k-Akt等多條下游信號通路，這些通路是細(xì)胞核內(nèi)主要調(diào)節(jié)通道，與腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、浸潤、轉(zhuǎn)移及血管生成等有關(guān)，說明MACC1可能在肺癌腫瘤血管生成起重要作用，但目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本文擬通過篩選MACC1表達(dá)較高的肺癌細(xì)胞株，化學(xué)合成MACC1基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染該細(xì)胞，下調(diào)MACC1基因表達(dá)，觀察MACC1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞促進(jìn)血管形成能力的影響，為研究MACC1基因在肺癌血管生成中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 A549，XWLC-05，GLC，SPC-A-1，YTMLC細(xì)胞由云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供，1640培養(yǎng)基、胰酶/乙二胺回乙酸(EDTA)消化液、無血清Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、LipofectamineTM 2000，Trizol總RNA提取試劑均購自Invitrogen公司。Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生化公司，MACC1及內(nèi)參上下游引物由蘇州金唯智生物公司合成，MACC1-siRNA 1～3及無義siRNA由廣州銳博生物有限公司合成，Platinum?SYBR?Green qPCR試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1肺腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 復(fù)蘇A549，XWLC-05，GLC，SPC-A-1，YTMLC細(xì)胞株，加入含10% FBS的1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d進(jìn)行常規(guī)換液傳代。

1.2.2RT-qPCR 法檢測細(xì)胞MACC1 mRNA的表達(dá) 采用Trizol 一步法提取各株細(xì)胞總RNA。取2 μg總RNA，參考逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA依照Platinum?SYBR?Green qPCR試劑盒說明書，行熒光定量PCR反應(yīng)。MACC1(481 bp)正義：5′-TCGGTCAGGAAGAATTGC-3′。反義：5′-CTCTAAGTCGTGTAGTAGGAT-3′，β-actin(564 bp)正義：5′-CTGGGACGACATGGAGAAA-3′，反義：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。反應(yīng)總體系25 μl，其中2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution為12.5 μl，10 μmol/L正義各0.5 μl，模板為1 μl，超純水為10.5 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min，之后每一步95℃變性15 s；59.5℃退火30 s；72℃延伸30 s共35個(gè)循環(huán)。溶解曲線階段：95℃變性15 s；60℃退火 30 s；72℃延伸30 s。所有樣本均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，最后由隨機(jī)附帶軟件LCS480 1.5.039計(jì)算Ct值和拷貝數(shù)，2-△△CT分析法進(jìn)行數(shù)值相對定量分析。

1.2.3MACC1 siRNA的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，針對人MACC1 cDNA (序列編號: NM2003467)的編碼序列。設(shè)計(jì)3條不同的siRNA序列及1條陰性對照siRNA序列：siRNA-1：AAAGACAGAAGGAGAAAGGdTdT；siRNA-2：AATCAACTGTCTGCTTCTAdTdT；siRNA-3：AATTATATGCCAGGACAGCdTdT；NT-siRNA：AACAGTTATCTATGCGACAdTdT。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及干擾效率的檢測 選擇MACC1 mRNA表達(dá)量最高的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用含100 ml/LFBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞濃度，接種無菌6孔板，每孔約1×105個(gè)細(xì)胞。待其生長至80%融合時(shí)，按照LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染前24 h將6孔板每孔加入Opti-MEM培養(yǎng)液2 ml。然后每孔加入siRNA-Lipofectamine 2000混合液500 μl，輕輕混勻，置于在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換成含血清的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為空白對照組、無義siRNA轉(zhuǎn)染組和MACC1-siRNA 1～3轉(zhuǎn)染組。siRNA濃度為50～100 nmol/L為初步預(yù)實(shí)驗(yàn)條件。

采用半定量RT-PCR方法于轉(zhuǎn)染后24 h時(shí)進(jìn)行沉默效率的檢測?？俁NA提取和cDNA的合成采用之前的方法。MACC1和β-actin的引物同前。采用天根公司PCR-MasterMix對各轉(zhuǎn)染組進(jìn)行半定量PCR。相同含量的PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。采用Bio-rad公司的Quantity One軟件進(jìn)行分析。β-actin作為歸一化內(nèi)參。半定量RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5雞胚尿囊膜(CAM)檢測血管生成情況 72 h后收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液，選擇表面清潔、蛋殼均質(zhì)、重量50～65 g、外形規(guī)范、氣室、氣孔均勻的種蛋為受試對象。孵育前用溫水(40℃～50℃)清洗2遍，以1∶1 000新潔爾滅溶液浸洗擦干。將種蛋置于(38.0±0.5)℃、相對濕度65%～70%的培養(yǎng)箱中孵化，在孵化過程中翻蛋2次/d，以防止胚胎發(fā)生粘連，并且促進(jìn)雞羊膜運(yùn)動(dòng)， 每日用透射燈檢查胚胎發(fā)育情況，第3天無血管出現(xiàn)者淘汰出實(shí)驗(yàn)，雞胚孵化第7天，在透射燈下觀察并確定CAM，將雞胚隨機(jī)分成三組，每組8只，用微量加樣器分別在CAM表面離開尿囊膜血管的空白處加100 μl的空白對照組上清液，100 μl MACC1-siRNA3組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，100 μl無義siRNA組細(xì)胞培養(yǎng)上清液。繼續(xù)孵育48 h，暴露加藥區(qū)尿囊膜，滴入固定液(甲醇和丙酮1∶1)固定15 min，待CAM上的血管凝固后，剝離假氣室周圍的蛋殼，使CAM充分暴露，以載體為中心用眼科剪剪下約3 cm×3 cm的尿囊膜，平鋪于平皿中展開，晾干，置于顯微鏡下觀察。取出CAM放在濾紙上，并以濾紙為背景，在自然光線下用數(shù)碼相機(jī)采用近距離模式原位于光學(xué)顯微鏡相同物鏡倍數(shù)(×10)下觀察血管分支并攝片，參考文獻(xiàn)〔7〕中的分析方法對血管面積進(jìn)行測定，計(jì)算面積比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，各肺癌細(xì)胞株中MACC1 mRNA的表達(dá)量與XWLC-05細(xì)胞之間的比較，不同MACC1-siRNA與無義siRNA組和對照組之間的比較，MACC1-siRNA實(shí)驗(yàn)組CAM與無義siRNA組和對照組CAM之間的比較均應(yīng)用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1RT-qPCR檢測各株細(xì)胞中MACC1 mRNA的表達(dá)情況 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，各株細(xì)胞中，XWLC-05細(xì)胞中MACC1的mRNA表達(dá)水平最高，SPC-A1肺腺癌細(xì)胞沒有檢測到MACC1 mRNA表達(dá)，提示其表達(dá)MACC1 mRNA的水平極低，其余各個(gè)細(xì)胞中MACC1 mRNA的表達(dá)量依次為A549>GLC>YTMLC。見表1。

2.2siRNA對XWLC-05細(xì)胞MACC1 mRNA 表達(dá)的影響 半定量RT-PCR結(jié)果顯示，各組可見亮度較均一的β-actin條帶，空白對照組及無義siRNA轉(zhuǎn)染組可見明顯的MACC1目的條帶，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染MACC1-siRNA1的XWLC005細(xì)胞中MACC1 mRNA的表達(dá)變化不太明顯，而MACC1-siRNA2和MACC1-siRNA3轉(zhuǎn)染組中的MACC1 mRNA表達(dá)水平明顯降低，其中MACC1-siRNA3的抑制率最高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此選用該siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖2。

表1 各肺癌細(xì)胞株中MACC1mRNA的表達(dá)量

1～6:siRNA1,siRNA2,SiRNA3,NT-siRNA,Cont,Marker

2.3MACC1-siRNA對CAM血管生成的影響 三組細(xì)胞上清液對雞胚的存活率沒有顯著影響。形態(tài)學(xué)上觀察，無義siRNA組及空白對照組可見稍多的血管分支，而MACC1-siRNA組則多見長且粗的大血管，血管分支較少。MACC1-siRNA3組血管面積〔(5.82±0.74)%〕較無義siRNA組〔(9.54±1.11)%〕及空白對照組〔(10.03±0.49)%〕減少(P<0.05)；而無義siRNA組及空白對照組組間比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

對照組 無義siRNA組 MACCl-siRNA組

3 討 論

本研究結(jié)果說明了MACC1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞促進(jìn)血管形成能力的影響，為進(jìn)一步研究肺癌血管生成機(jī)制奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

腫瘤異質(zhì)性理論認(rèn)為，腫瘤是一個(gè)由具有不同遺傳背景的細(xì)胞亞群組成的異質(zhì)性群體，在一個(gè)原發(fā)腫瘤細(xì)胞群中，并不是所有瘤細(xì)胞具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力，這說明不同肺癌細(xì)胞之間具有不同的腫瘤異質(zhì)性，而這種腫瘤異質(zhì)性如遷移、黏附等生物學(xué)行為與不同肺癌細(xì)胞某些基因的突變有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR檢測顯示各肺癌細(xì)胞株細(xì)胞中MACC1 mRNA的表達(dá)不一致，在所檢測的五株肺癌細(xì)胞株中MACC1 mRNA的表達(dá)量依次為XWLC-05>A549>GLC>YTMLC> SPC-A1，MACC1在不同肺癌細(xì)胞中表達(dá)的差異性，可能是不同肺癌細(xì)胞具有不同的惡性生物學(xué)特性，如侵襲和轉(zhuǎn)移的原因之一。

Arlt等〔8〕發(fā)現(xiàn)MACCl表達(dá)水平上調(diào)者術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)明顯增加。進(jìn)一步研究顯示MACC1在良性向惡性轉(zhuǎn)化組織中的表達(dá)逐漸升高，原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤中MACC1表達(dá)水平明顯增高，尤其在發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者，其表達(dá)水平能反映原發(fā)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力〔2,8〕。而腫瘤血管形成能為腫瘤細(xì)胞的播散提供最直接的通道，是腫瘤細(xì)胞遷移游走形成轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究說明干擾MACC1后腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)微血管生成潛能明顯減弱，提示MACC1與宣威肺腺癌細(xì)胞株XWLC-05誘導(dǎo)微血管形成相關(guān)。

血管形成是促血管生成因子與抑制因子互相作用的結(jié)果，先前文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤細(xì)胞本身可以合成分泌促血管生成因子包括多種生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族、血管生成素家族以及血管生成相關(guān)性趨化因子和細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL-8)等，誘導(dǎo)血管生成。而這些促血管生成因子的分泌受HGF/c-MET調(diào)節(jié)，作為HGF/c-MET信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子MACC1能有效降低宣威肺腺癌細(xì)胞XWLC-05誘導(dǎo)CAM微血管形成的能力，其具體調(diào)控機(jī)制如何需要進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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