劉雪飛

(白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 白城 137000)

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年提高。研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生異常時，將導(dǎo)致細胞快速增殖、無限生長，最終形成腫瘤。胰島素樣生長因子(IGFs)在乳腺腺體發(fā)育和乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。IGF-1可通過自分泌和旁分泌的方式參與正常乳腺上皮細胞、良性和惡性乳腺腫瘤細胞的促分裂、抗凋亡效應(yīng)，在乳腺病的形成過程中起重要作用〔1～4〕。木犀草素是從多種蔬菜、水果中分離出的一種天然黃酮類化合物。目前，體內(nèi)外實驗驗證了木犀草素的抗腫瘤活性，其抗癌譜較廣，毒性很低，是較為理想的抗腫瘤藥物。本文旨在探討木犀草素應(yīng)用于乳腺癌臨床治療的可行性。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 木犀草素購自中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%。MCF-7 細胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細胞中心。小牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基均購自GIBCO 公司，胰蛋白酶購自PAA公司。Trizol購自Invintrigen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑和DNA Marker均購自Taraka公司。IGF-1引物及內(nèi)參照β-actin由北京華大基因有限公司合成。IGF-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自Sigma公司。

1.2引物設(shè)計 IGF-1正義序列為：5′-ATGAGTTCTGACACGGCGG-3′，反義序列為：5′-GTCGACCTAGGCACGGACGG-3′，擴增目的片段長度為210 bp。內(nèi)參照物：β-actin正義：5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，反義：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，擴增目的片段長度為202 bp。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期MCF-7細胞進行細胞傳代，先棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶消化，消化后棄去胰酶，補加適量培養(yǎng)基，制備單細胞懸液。調(diào)整細胞濃度為2×104個/ml，以每孔4 000個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，加入終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μmol/L的木犀草素溶液與細胞共同孵育24、48、72 h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，Trizol法提取細胞RNA，提取的RNA在-80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2熒光定量PCR法檢測IGF-1的表達 根據(jù) TaqMan?PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ說明書，以提取的 RNA 為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。全過程在冰上進行操作。反應(yīng)條件：37℃ 15 min；85℃ 5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，5 s 后降溫至4℃。以不同反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，進行熒光定量檢測。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為20 μl，SYBR?Premix Ex TaqTM10 μl，Rox 0.4 μl，引物2.0 μl，模板1.0 μl，水6.6 μl。反應(yīng)條件為95℃，30 s 95℃，5 s 55℃，33 s 40個循環(huán)；95℃ 15 s，55℃ 60 s，95℃ 15s。熒光定量PCR結(jié)果采用△△CT 法進行分析，相對定量結(jié)果按 2-△△CT進行計算。

1.3.3ELISA法檢測IGF-1的分泌 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以2×104個/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h。無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后，加入含0、10、20、40 μmol/L木犀草素的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24 h后，收集上清液，按照 IGF-1ELISA試劑盒操作要求，依次進行加樣、孵育、洗滌，用酶標儀于450 nm波長下測定上清液的光吸收值。用Curve Exert 1.3軟件繪制標準曲線，計算IGF-1含量。IGF-1的檢測靈敏度為1.0 ng/ml。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS16.0軟件進行分析。多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1木犀草素對MCF-7細胞中IGF-1 mRNA水平變化的影響 MCF-7 細胞表達IGF-1。木犀草素能夠影響 MCF-7 細胞IGF-1的表達水平，且呈時間和劑量依賴關(guān)系。即隨著木犀草素濃度的增加，作用時間的延長，IGF-1的相對表達量顯著降低(P<0.01)。見圖1。

圖1 IGF-1 mRNA 在木犀草素作用不同時間后MCF-7細胞中的相對表達量

2.2木犀草素對MCF-7細胞中IGF-1含量的影響 MCF-7 細胞可向細胞培養(yǎng)基中分泌IGF-1。木犀草素能夠影響 MCF-7 細胞分泌 IGF-1，且呈時間和劑量依賴關(guān)系。40 μmol/L木犀草素作用于細胞24 h后，與對照組相比，IGF-1含量顯著降低35.6%(P<0.05)。見表1。

表1 木犀草素對不同培養(yǎng)時間MCF-7細胞中IGF-1含量的影響±s,ng/ml)

3 討 論

目前，分子靶向藥物是用于乳腺癌治療的研究熱點之一。由于化學(xué)藥物治療法和放射治療法對于患者存在很大的危險性，各國學(xué)者正在尋找抗腫瘤效果好、安全性高、副作用小的天然的抗乳腺癌藥物。黃酮類藥物以其種類多、安全性強、抗腫瘤譜廣泛、抗腫瘤細胞增殖作用效果明顯、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，成為國內(nèi)外篩選抗腫瘤藥物的重要資源之一。木犀草素是從天然藥物、蔬菜果實中分離得到的一種有較強抗腫瘤活性的天然黃酮類化合物，具有廣譜抗腫瘤活性。

木犀草素分布廣泛于自然界中，可從金銀花、菊花等多種天然藥物和芹菜、甜椒等蔬菜果實中分離得到?；瘜W(xué)名為3′，4′，5，7-四羥基黃酮，化學(xué)式為C15H10O6。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能抑制多種腫瘤細胞的增殖作用。Chang等〔5〕發(fā)現(xiàn)低劑量的木犀草素可抑制5種肝癌細胞系PLC/PRF/5、Hep 3B和HA22T/VGH細胞的增殖，但需較高的濃度木犀草素才能抑制HepG2 和SK-Hep 1的增殖作用。Wu等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素還可以劑量時間依賴的方式抑制胃癌細胞的生長，并可將細胞周期阻滯在G2/M期，上調(diào)caspase-3，6，9，Bax，p53蛋白的表達，下調(diào)bcl-2的表達，來抑制胃癌細胞的增殖作用。木犀草素還能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。Brusselmans等〔7〕指出，木犀草素可以抑制乳腺癌和前列腺癌細胞的脂肪酸合成酶活性，從而發(fā)揮其抗腫瘤細胞增長和誘導(dǎo)其凋亡的作用。還有研究顯示，用木犀草素處理人肺癌A549細胞，流式細胞儀分析可顯示出Sub-G1期峰值， PCR分析檢測出caspase-3基因表達降低，WB檢測出caspase-3蛋白表達降低，說明木犀草素可誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡〔8〕。同時，木犀草素還可作為腫瘤細胞凋亡增敏劑，Du等〔9〕研究表明，木犀草素可抑制乳腺癌細胞的生長，并可增敏阿霉素對乳腺癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。另外，木犀草素還能影響腫瘤細胞周期分布。Kim等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以顯著抑制血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞的增殖作用，并可將細胞周期阻滯于G1期。此外，木犀草素可封閉血管內(nèi)皮細胞黏附分子的黏附，以限制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移；還可抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞的生長，以減少腫瘤組織血管生成，從而限制腫瘤生長〔11〕。

IGF-1 是一種重要的多功能細胞因子，與胰島素高度同源，具有快速代謝效應(yīng)和促分裂效應(yīng)〔12〕。在機體內(nèi)當(dāng) IGF-1與 IGF-IR 形成配體受體復(fù)合物時，引起受體聚集、自磷酸化和酪氨酸激酶的活化等一系列變化，激活PI3K/Akt和 Ras-MAPK兩條信號通路〔13～15〕，產(chǎn)生促進細胞增殖﹑存活及抗細胞凋亡的作用。有文獻報道，乳腺癌患者患病組織IGF-1呈高表達狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1 能誘導(dǎo)乳腺上皮細胞中血管生成因子的大量表達，促進腫瘤組織的血管生成，從而誘導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)化〔16〕。同時參與腫瘤細胞周期調(diào)節(jié)等效應(yīng)，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，在乳腺癌 MCF-7細胞中添加木犀草素，能顯著抑制IGF-1基因的表達，并隨著木犀草素濃度的增加，IGF-1相對表達量逐漸降低。木犀草素可以抑制IGF-1基因的表達，實現(xiàn)對IGF-1介導(dǎo)的信號通路進行干擾，進而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。在對培養(yǎng)的MCF-7細胞上清液中進行IGF-1含量檢測時發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌 MCF-7細胞中添加木犀草素，能顯著抑制上清液中IGF-1的分泌，并隨著木犀草素濃度的增加，IGF-1分泌量逐漸降低。這與木犀草素對IGF-1基因表達的影響相一致。這表明，木犀草素對MCF-7細胞IGF-1的影響在基因水平和蛋白水平都能實現(xiàn)。木犀草素通過抑制IGF-1基因表達及其分泌，實現(xiàn)對IGF-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行干擾，進而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

綜上，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜過程，抗腫瘤藥物的作用靶點也多種多樣，明確木犀草素對乳腺癌發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵細胞因子的影響，對分析木犀草素的詳細抗腫瘤通路奠定實驗基礎(chǔ)，也將為今后的抗腫瘤安全特效藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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