朱洪艷，陳蓉，姜藻

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腫瘤中心，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)江蘇省分子影像與功能影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

肝細(xì)胞癌(hepatocellar carcinoma，HCC)是發(fā)病率僅次于胃癌的消化道惡性腫瘤之一，其血管化程度極高，病程進(jìn)展迅速，目前尚缺乏有效性及安全性俱佳的治療方法[1- 2]，人們迫切期待安全有效的治療手段的出現(xiàn)，大多數(shù)學(xué)者把希望投向基因治療。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells， EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可定向遷移到肝癌組織，在其他重要臟器中分布較少[3]，讓其攜帶自殺基因去殺傷肝癌細(xì)胞成為人們研究肝癌治療方法的新希望。本研究擬將自殺基因胞嘧啶脫氨酶(cytosicine deaminase，CD)基因轉(zhuǎn)染至鼠髓源性EPCs中，聯(lián)合使用酶前體藥物5- 氟胞嘧啶(5- FC)，觀察CD基因修飾的EPCs與5- FC對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞的體外抗增殖作用，為干細(xì)胞/祖細(xì)胞作為基因治療載體治療肝細(xì)胞癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及后續(xù)臨床研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

5～6周齡普通昆明小鼠25只，雌雄不拘，體重20～30 g，由東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并飼養(yǎng)于該動(dòng)物中心。肝癌H22細(xì)胞株購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所。慢病毒載體plenti6.3- EGFP- CD及慢病毒對(duì)照液plenti6.3/V5- DEST來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室前期工作[4]保存。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液(EBM- 2)、Single Quots組合添加劑(Lonza，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)基粉(RPMI1640)、高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國(guó))，CD31 抗體(eBioscience公司，美國(guó))，KDR抗體(Cell Signaling公司，美國(guó))，F(xiàn)ITC- UEA- 1(Vector Laboratries公司)，Dil- ac- LDL(Biomedical Technologies公司，美國(guó))，DAPI- Fluoromount- G(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，Polybrene轉(zhuǎn)染試劑(中山生物工程有限公司)，β- actin單克隆抗體和抗CD單克隆抗體(Sigma公司，美國(guó))，CCK- 8試劑盒(上海易莎生物科技有限公司)，Transwell小室裝置(北京樂博生物科技有限公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Herabus，德國(guó))，倒置相差顯微鏡(Zeiss Axiovert25 CFL)，凈化工作臺(tái)(吳江市生化凈化設(shè)備廠)，原子吸收光譜儀(9602A，沈陽(yáng)華光精密儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠骨髓EPCs分離、培養(yǎng)及鑒定

斷頸法處死昆明小鼠，密度梯度離心法分離小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)室已建立的實(shí)驗(yàn)方法[4- 5]進(jìn)行EPCs的培養(yǎng)和鑒定。細(xì)胞爬片、冷丙酮固定后滴加CD31、KDR一抗溶液，37 ℃孵育1 h，陰性對(duì)照用PBS液代替一抗。沖洗干凈后滴加二抗工作液，37 ℃避光孵育30 min，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表面標(biāo)記CD31和KDR表達(dá)情況。另外再選取生長(zhǎng)良好的原代細(xì)胞，分別加入5 μg·ml-1Dil- ac- LDL和10 μg·ml-1FITC- UEA- 1后，熒光顯微鏡下觀察EPCs攝取Dil- ac- LDL和結(jié)合FITC- UEA- 1情況。

1.2.2 目的基因的轉(zhuǎn)染和鑒定

取生長(zhǎng)旺盛的EPCs消化并計(jì)數(shù)，將5×104個(gè)細(xì)胞分別與攜帶目的基因(plenti6.3- EGFP- CD)的病毒液和慢病毒對(duì)照液(plenti6.3/V5- DEST)在8 μg·ml-1的Polybrene存在下進(jìn)行高速離心和轉(zhuǎn)染培養(yǎng)，以未轉(zhuǎn)染的EPCs為對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)情況。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好、成功轉(zhuǎn)染CD基因的EPCs細(xì)胞，胰酶消化后加培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后溫箱培養(yǎng)2 d，取其培養(yǎng)上清液行Western blotting，檢測(cè)CD蛋白表達(dá)，僅轉(zhuǎn)染慢病毒的EPCs上清液和未轉(zhuǎn)染的EPCs上清液為對(duì)照組。

1.2.4 H22細(xì)胞體外抑制實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 H22細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 復(fù)蘇肝癌H22細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化后，用1640培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后備用。利用Transwell小室共培養(yǎng)體系，將H22細(xì)胞均勻接種于Transwell上室(六孔板)，分別將轉(zhuǎn)染CD基因的EPCs(以下簡(jiǎn)稱實(shí)驗(yàn)組)、轉(zhuǎn)染空病毒的EPCs(以下簡(jiǎn)稱空病毒組)、未轉(zhuǎn)染的EPCs(以下簡(jiǎn)稱陰性對(duì)照組)單細(xì)胞懸液均勻加入Transwell下室，每組6孔，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4.2 CCK- 8法檢測(cè)CD/5- FC系統(tǒng)對(duì)H22細(xì)胞增殖的影響 將不同濃度的5- FC培養(yǎng)液分別加入含H22細(xì)胞的Transwell上室，5- FC濃度分別為20、60、80、100、120 mg·L-1，不加5- FC為對(duì)照組，放置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。96 h后Transwell上室每孔加入CCK8 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)2 h，分別在酶標(biāo)儀450 nm處讀取OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)，IR=(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/對(duì)照孔OD值×100%。

1.2.4.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)H22細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)CCK- 8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出IR值大于50%的5- FC濃度為IC50。同CCK- 8法操作步驟，將H22細(xì)胞均勻接種于Transwell上室，將各組EPCs加入Transwell下室，最后將IC50濃度的5- FC加入Transwell上室，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h后取出上室中的H22細(xì)胞懸液加入2 ml圓底離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入PBS 1 ml離心洗滌，70%酒精固定，先后加入5 μl Annexin V- FITC、5 μl PI孵育30 min，混勻，過300目篩網(wǎng)，置流式管中，用流式細(xì)胞儀及ModFit軟件檢測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 鼠髓源性EPCs培養(yǎng)及鑒定

EPCs培養(yǎng)成功，14 d時(shí)倒置相差顯微鏡下可觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)呈鵝卵石狀(圖1)。熒光顯微鏡下培養(yǎng)細(xì)胞中均可見綠色熒光，胞核呈藍(lán)色，證實(shí)該細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記CD31和內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)記KDR，為EPCs；培養(yǎng)細(xì)胞ac- LDL內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)及UEA- 1結(jié)合實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，超過90%的細(xì)胞為雙染陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)培養(yǎng)的絕大部分細(xì)胞為EPCs。鑒定結(jié)果圖參見已發(fā)表文獻(xiàn)[6]。

A.培養(yǎng)第7天時(shí)，細(xì)胞呈梭形 ×100；B.第14天時(shí)，細(xì)胞呈鵝卵石樣改變 ×200

圖1倒置相差顯微鏡下鼠髓源性EPCs形態(tài)學(xué)變化

Fig1MorphologyofEPCsderivedfrommicemarrow

2.2 目的基因轉(zhuǎn)染檢測(cè)

由于EGFP基因與CD基因?yàn)槿诤匣?，CD基因轉(zhuǎn)染成功后的EPCs因含有綠色熒光蛋白，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的EPCs未顯示綠色熒光。見圖2。

2.3 目的蛋白的表達(dá)情況

Western blotting法判定標(biāo)準(zhǔn)：顯色后，內(nèi)對(duì)照β- actin條帶及CD蛋白條帶同時(shí)出現(xiàn)者為陽(yáng)性結(jié)果，僅出現(xiàn)內(nèi)對(duì)照β- actin條帶者為陰性結(jié)果。鑒定結(jié)果如圖3顯示：轉(zhuǎn)染空病毒及未轉(zhuǎn)染的EPCs的上清液呈陰性結(jié)果，轉(zhuǎn)染CD基因的EPCs的上清液出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，其有CD蛋白表達(dá)。

2.4 CCK- 8法檢測(cè)H22細(xì)胞增殖情況

96 h后測(cè)得的450 nm吸光度值(OD值)如圖4所示：與空病毒組和對(duì)照組不同，實(shí)驗(yàn)組隨著5- FC濃度增加，OD值逐漸下降，在80、100、120 mg·L-1濃度下，實(shí)驗(yàn)組OD值與對(duì)照組、空病毒組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但空病毒組各個(gè)濃度與對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。計(jì)算不同濃度的腫瘤細(xì)胞增殖抑制率，隨著5- FC濃度增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加，如圖5所示：5- FC濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，腫瘤細(xì)胞增殖抑制過半，約(54.74±5.38)%,即本實(shí)驗(yàn)中5- FC的IC50為100 mg·L-1；而空載體組和對(duì)照組腫瘤增殖抑制相對(duì)極少。

A.未經(jīng)轉(zhuǎn)染的EPCs(倒置相差顯微鏡下);B.plenti6.3- EGFP- CD成功轉(zhuǎn)染的EPCs(熒光顯微鏡下)

圖2轉(zhuǎn)染成功的EPCs中CD基因的表達(dá)×100

Fig2ExpressionofCDgenetransfectedsuccessfully

A.未轉(zhuǎn)染的EPCs上清液;B.轉(zhuǎn)染空病毒的EPCs上清液;C.轉(zhuǎn)染CD基因的EPCs上清液

圖3Westernblotting鑒定CD蛋白表達(dá)

Fig3TheexpressionofCDproteintestedbyWesternblotting

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H22細(xì)胞凋亡

96 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均凋亡率為(48.71±4.62)%，空病毒組為(11.22±2.16)%，而對(duì)照組細(xì)胞自然凋亡率僅為(9.71±1.80)%，實(shí)驗(yàn)組與空病毒組及對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，后兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

3 討 論

新生血管的建立是惡性腫瘤得以不斷增殖和轉(zhuǎn)移的重要一步。文獻(xiàn)報(bào)道骨髓源性EPCs在腫瘤血管形成中的作用仍存在爭(zhēng)議[7]。其可通過潛在的旁分泌功能，分泌促血管生成因子，如VEGF、血管生成素- 1、SDF- 1及血管生成素- 2，間接參與和影響腫瘤新生血管形成[8- 9]。Massard等[10]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)VEGFR2+骨髓源性EPCs在預(yù)測(cè)癌癥晚期病人死亡風(fēng)險(xiǎn)中具有重要價(jià)值。在肝癌研究領(lǐng)域，Shih等[11]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞可增加骨髓源性EPCs的趨向性[12]。Yu與同事[13]的研究顯示，肝癌時(shí)腫瘤周圍相鄰組織微血管(adjacent non- tumor tissues，AT)與腫瘤血管(tumor vessels，TT)相比，募集了更多的EPCs，腫瘤周圍細(xì)胞所表達(dá)的血管生成因子如VEGF- A、bFGF、TGF- b、MCP- 1、TSP- 1、MMP- 9、TIMP- 2和內(nèi)皮抑素水平促進(jìn)了EPCs的募集，提示腫瘤周圍微環(huán)境在肝癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起重要作用，而EPCs可能是肝癌輔助治療潛在的新載體或靶點(diǎn)。利用EPCs對(duì)富血管腫瘤的形成和發(fā)展的影響及趨化作用，可將其作為治療遞送載體，攜帶自殺基因、抗血管生成基因或腫瘤抑癌基因等殺死腫瘤細(xì)胞或抑制血管生成從而治療肝癌。Arafat等[14]首次提出了利用基因修飾EPCs，通過誘導(dǎo)進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與空病毒組比較，bP<0.05

圖4CD/5-FC系統(tǒng)作用下肝癌H22細(xì)胞增殖情況

Fig4EffectsofCD/5-FCsystemonproliferationofH22cells

圖5CD/5-FC系統(tǒng)對(duì)肝癌H22細(xì)胞株增殖抑制率

Fig5InhibitionproliferationrateofCD/5-FCsystemonH22celllines

A.對(duì)照組

B.空病毒組

C.實(shí)驗(yàn)組

圖6CD/5-FC系統(tǒng)作用H22細(xì)胞96h的細(xì)胞凋亡情況

Fig6ApoptosisofH22cellstreatedwithCD/5-FCsystemfor96h

自殺基因作為治療惡性腫瘤的一種手段，近年來(lái)備受關(guān)注，其有一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)是“旁觀者效應(yīng)(bystander effect)”，即轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的毒性藥物代謝物在殺傷自己的同時(shí)，還可通過不同的方式，造成其鄰近未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的殺傷，因此可取得顯著的殺瘤效果。此現(xiàn)象產(chǎn)生考慮可能與縫隙連接、細(xì)胞凋亡、免疫介導(dǎo)、腫瘤缺血壞死等有關(guān)。利用自殺基因引起的“旁觀者效應(yīng)”并結(jié)合EPCs作為治療遞送載體趨向肝癌細(xì)胞的特性，探索肝癌治療的研究越來(lái)越多[3]。自殺基因CD的表達(dá)蛋白即胞嘧啶脫氨酶可催化胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶，使無(wú)毒性的前藥5- 氟胞嘧啶(5- FC)轉(zhuǎn)變成高毒性的化療藥物5- 氟尿嘧啶(5- FU)。本實(shí)驗(yàn)中，我們使用Transwell小室共培養(yǎng)體系，觀察不同濃度5- FC作用下小鼠肝癌H22細(xì)胞增殖變化，分析CD/5- FC系統(tǒng)體外抗腫瘤效果，其優(yōu)點(diǎn)是排除了CD/5- FC系統(tǒng)對(duì)于EPCs的殺傷作用和EPCs自然凋亡的影響，使腫瘤細(xì)胞增殖凋亡分析免受干擾。結(jié)果顯示，該系統(tǒng)在體外可顯著抑制肝癌H22細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，且與5- FC濃度效應(yīng)有關(guān)，這為下一步體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)及模擬治療療程提供了理論基礎(chǔ)，但其具體分子生物學(xué)機(jī)制尚待更深一步研究。

該實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了慢病毒載體作為轉(zhuǎn)基因的工具，具有高效轉(zhuǎn)導(dǎo)率和穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)[4]，且不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及結(jié)果產(chǎn)生明顯影響，因而是目前體內(nèi)轉(zhuǎn)基因乃至基因治療較為合適的載體。同時(shí)，在轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)觀察方法方面，我們采用熒光標(biāo)記觀察。EGFP因帶有綠色熒光標(biāo)志，可間接反映目的基因CD的表達(dá)，這樣可以很方便、快捷和較準(zhǔn)確地直接在熒光顯微鏡下檢測(cè)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)情況。

雖然關(guān)于EPCs作為自殺基因載體治療肝細(xì)胞癌在臨床上的有效性及安全性還有待于進(jìn)一步證實(shí)，但其對(duì)將來(lái)的肝癌抗腫瘤治療策略的價(jià)值是毋庸置疑的。本實(shí)驗(yàn)組對(duì)自殺基因修飾內(nèi)皮祖細(xì)胞治療小鼠原位肝細(xì)胞癌的體內(nèi)研究尚在進(jìn)行中。隨著各項(xiàng)生物信息技術(shù)的全面深入，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步探討與肝癌相關(guān)的基因治療的分子生物學(xué)機(jī)制及臨床可行性。

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