文小平，夏海鳴

(1.東南大學 醫(yī)學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 附屬第二醫(yī)院，江蘇 南京 210003)

目前認為，白介素6(interleukin- 6,IL- 6)與腎上腺皮質(zhì)功能密切相關(guān)，它可以通過下丘腦- 垂體- 腎上腺(Hypothalamic- Pituitary- Adrenal，HPA)軸調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)功能，也可直接作用于腎上腺來影響腎上腺皮質(zhì)功能。此外，腎上腺自身可分泌IL- 6，通過自分泌或旁分泌方式參與腎上腺皮質(zhì)功能的調(diào)節(jié)。但IL- 6對腎上腺皮質(zhì)功能的具體影響及調(diào)節(jié)機制仍不明確。本研究旨在探討IL- 6單獨及聯(lián)合ACTH處理小鼠腎上腺皮質(zhì)細胞后皮質(zhì)醇合成水平的變化，以及皮質(zhì)醇合成過程中類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)相關(guān)基因的調(diào)控作用，從而為今后深入了解內(nèi)毒素休克過程中IL- 6對腎上腺皮質(zhì)功能的影響提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腎上腺皮質(zhì)細胞系Y1(中科院上海細胞生物研究所)，IL- 6(Prospec公司)，ACTH(Sigma公司)，F(xiàn)12培養(yǎng)基(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，胎牛血清(GIBCO公司)，臺盼藍染液(南京生興生物科技有限公司)，皮質(zhì)醇放免檢測試劑盒(原子高科股份有限公司)，Trizol(美國Invitrogen)，cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Thermo Fisher)，TaqDNA Polymerase(美國Thermo Fisher)，Real time PCR Master Mix(SYBR Green)(日本TOYOBO)，0.1% DEPC水(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，引物由上海英俊公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

小鼠腎上腺皮質(zhì)細胞系Y1細胞用含10%的胎牛血清、1.176 g NaHCO3及100 U·L-1青鏈霉素的F12培養(yǎng)液，在體積分數(shù)為5%CO2、37 ℃濕飽和的條件下培養(yǎng)。細胞生長至80%融合時，以0.25%的混合胰酶消化后按1瓶傳至2～3瓶進行傳代，取其對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 臺盼藍拒染法檢測細胞活性

取對數(shù)生長期的Y1細胞，調(diào)整細胞濃度為1.0×105ml-1，接種于6孔板，每孔1 ml，F(xiàn)12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后按照以下分組來添加不同物質(zhì)：(1) 空白對照組：2 ml F12培養(yǎng)液；(2) IL- 6組：2 ml F12培養(yǎng)液含100 ng·ml-1IL- 6；(3) ACTH組：2 ml F12培養(yǎng)液含10-9mol·l-1ACTH；(4) IL- 6+ACTH組：2 ml F12培養(yǎng)液含100 ng·ml-1IL- 6和10-9mol·l-1ACTH；再按照4個時間點分別培養(yǎng)3、6、12、24 h終止實驗。取細胞上清液于無菌EP中，混勻后以2 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-20 ℃保存。在6孔板中按1∶10加入0.4%的臺盼藍，染色2～3 min，在光學顯微鏡下做活細胞計數(shù)，實驗重復3次。結(jié)果統(tǒng)計：光鏡下任取5個視野進行活細胞計數(shù)，細胞活性=活細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100%。

1.4 放免法檢測皮質(zhì)醇

從冰箱中取出經(jīng)1.3方法處理的上清液，室溫溶解后通過放免法測定各組細胞上清中皮質(zhì)醇含量。根據(jù)皮質(zhì)醇放免檢測試劑盒的操作說明，用放免儀測各管沉淀的放射性計數(shù)(cmp)，實驗重復3次。自動γ計數(shù)器預先編制程序，直接給出實驗的有關(guān)參數(shù)，標準曲線及樣品濃度。測得的數(shù)據(jù)中，皮質(zhì)醇以g·ml-1為單位。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測StAR mRNA的表達

取對數(shù)生長期的Y1細胞，調(diào)整細胞濃度為1.0×105ml-1，接種于6孔板，每孔1 ml。以F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后按照以下分組來添加不同物質(zhì)：(1) 空白對照組：2 ml F12培養(yǎng)液；(2) IL- 6組：2 ml F12培養(yǎng)液含100 ng·ml-1IL- 6；(3) ACTH組：2 ml F12培養(yǎng)液含10-9mol·l-1ACTH；(4) IL- 6+ACTH組：2 ml F12培養(yǎng)液含100 ng·ml-1IL- 6和10-9mol·l-1ACTH;24 h終止實驗。用Trizol裂解細胞提取各組總RNA，純化后用DEPC水溶解RNA，并分別在260 nm和280 nm處測其吸光度，計算出OD260/280值。引物是根據(jù)GenBank收錄的小鼠StAR和GAPDHmRNA序列，由Primer 5軟件設(shè)計，由上海英俊公司合成，序列見表1。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行操作，得到cDNA。用ABI Step one plus Real time- PCR儀進行擴增反應，體系總體積為20 μl：SYBR Green為10 μl，cDNA為 1 μl，引物為2 μl，0.1% DEPC水為7 μl。擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，40個循環(huán)，72 ℃延伸40 s。每個樣品3個復孔，于72 ℃、40 s時計算熒光值，實驗重復3次。用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析。

表1用于實時熒光定量PCR的引物序列

Tab1SequencesoftheprimersusedforrealtimeRT-PCR

引物名稱引物序列GAPDHSense primer:5-AAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3Antisense primer:5-AGATGATGACCCTTTTGGCTC-3StARSense primer:5-CTTGGCTGCTCAGTATTGAC-3Antisense primer:5-TGGTGGACAGTCCTTAACAC-3

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 臺盼藍拒染法檢測細胞活性

見表2。

組 別處理不同時間后Y1細胞的活力/×100%3 h6 h12 h24 h空白對照組60±555±758±560±2IL-6組68±4a70±4a75±3a80±3aACTH組70±10a73±8a79±3a84±5aIL-6+ACTH組75±15a75±10a85±10a90±15a

與空白對照組比較，aP>0.05

實驗結(jié)果顯示：IL- 6單獨或聯(lián)合ACTH處理Y1細胞不同時間后，各組的細胞活力與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著時間增加，各組細胞活力雖有明顯增強，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 IL- 6單獨或聯(lián)合ACTH處理Y1細胞后皮質(zhì)醇的合成量

見圖1。

與空白對照組比較，aP<0.05

Fig1ThesynthesisofcorticosteroidinY1cellstreatedbyⅠL- 6aloneorcombinedwithACTH

實驗結(jié)果顯示：隨著IL- 6處理Y1細胞的時間增加，皮質(zhì)醇合成量也增加，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(6 h后，P<0.05)；ACTH處理Y1細胞不同時間段，隨時間增加，皮質(zhì)醇合成顯著增加，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(3 h后，P<0.05)；IL- 6和ACTH聯(lián)合作用Y1細胞，隨時間增加，皮質(zhì)醇合成量進一步上升，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(3 h后，P<0.05)。

2.3 IL- 6單獨或聯(lián)合ACTH處理Y1細胞后StAR mRNA的表達

見表3。

組 別StAR mRNA△CTFold(2-△△CT)空白對照組9.83±0.151.00±0.11IL-6組9.10±0.151.67±0.17ACTH組8.90±0.062.06±0.34IL-6+ACTH組8.40±0.352.75±0.61

實驗結(jié)果顯示：IL- 6、ACTH分別作用于Y1細胞24 h后，StAR mRNA的表達增強，與空白對照組對比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IL- 6和ACTH聯(lián)合處理Y1細胞24 h后，StAR mRNA的表達進一步增強，與空白對照組對比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

2000年，Annane等首次提出相對腎上腺皮質(zhì)功能不全(relative adrenal cortical dysfunction，RAI)的概念：即處于嚴重應激狀態(tài)時，患者體內(nèi)的皮質(zhì)醇水平代償性升高，但升高程度或者持續(xù)時間仍不能滿足機體需要，即為RAI[1]。Dalegrave等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素休克患者并發(fā)RAI的概率達22%～55%[2]。內(nèi)毒素休克時RAI發(fā)生機制尚不完全清楚，但內(nèi)毒素休克時大量釋放的炎性因子與腎上腺皮質(zhì)功能密切相關(guān)。IL- 6是參與內(nèi)毒素休克的重要炎癥因子之一，對腎上腺皮質(zhì)功能的影響值得進一步探討。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子與腎上腺皮質(zhì)激素的合成密切相關(guān)：腫瘤壞死因子- α可抑制牛腎上腺皮質(zhì)細胞合成皮質(zhì)醇[3]，白介素4可促進牛腎上腺皮質(zhì)細胞合成皮質(zhì)醇[4]。體外實驗結(jié)果表明，采用不同濃度(10～200 ng·ml-1)的IL- 6處理從腎口腺皮質(zhì)細胞不同時間(4～24 h)后皮質(zhì)醇合成量開始增加[5]。

本研究前實驗分別用1、10、100 pg·ml-1和1、10、100、200、400 ng·ml-1的IL- 6同時處理Y1細胞，12 h后發(fā)現(xiàn)，當IL- 6濃度達1 ng·ml-1后細胞合成皮質(zhì)醇量增加，100 ng·ml-1皮質(zhì)醇合成量增加達峰值，超過100 ng·ml-1皮質(zhì)醇合成量開始下降；用100 ng·ml-1IL- 6分別處理Y1細胞3、6、12、24、48 h，發(fā)現(xiàn)作用6 h后Y1細胞合成皮質(zhì)醇量增加，24 h達到峰值，超過24 h后皮質(zhì)醇合成量開始下降；用100 ng·ml-1IL- 6聯(lián)合10-9mol·l-1ACTH處理細胞3 h后皮質(zhì)醇合成量明顯增加。這些濃度、時間差異性的產(chǎn)生可能與細胞種屬、細胞活性及培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，也可能與實驗試劑的質(zhì)量相關(guān)。

有研究結(jié)果顯示，IL- 6(4.8×10-9mol·L-1)處理腎上腺皮質(zhì)細胞48 h后細胞數(shù)量及細胞活力均無變化[6]。本研究用100 ng·ml-1IL- 6單獨以及聯(lián)合10-9mol·l-1ACTH共同處理Y1細胞不同時間后發(fā)現(xiàn)，細胞活性與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。因此，后續(xù)實驗中使用100 ng·ml-1的IL- 6及10-9mol·L-1的ACTH，排除IL- 6和(或)ACTH對Y1細胞活性的影響。

綜上所述，IL- 6可促進Y1細胞合成皮質(zhì)醇，但其具體機制仍不明確。2004年，Rainey等[7]研究發(fā)現(xiàn)了腎上腺皮質(zhì)細胞的皮質(zhì)醇合成通路，即在腎上腺皮質(zhì)以膽固醇為基本“原料”，通過StAR介導，進入線粒體內(nèi)膜后經(jīng)過一系列特異性酶催化作用，包括多種形式的細胞色素P450系列酶和3β羥基固醇脫氫酶(3 beta hydroxy cholesterol dehydrogenase，3β- HSD)，最終合成皮質(zhì)醇。Y1細胞系是一種研究腎上腺類固醇合成與代謝途徑中多種基因表達和調(diào)控的較好細胞模型，其功能與原代腎上腺皮質(zhì)細胞相似，受ACTH刺激后，細胞合成類固醇能力可顯著增加。本研究采用10-9mol·L-1的ACTH刺激Y1細胞后，皮質(zhì)醇合成量明顯增加，間接證明了Y1細胞活性良好。

細胞因子的生物學功能是通過與靶細胞膜表面的受體相結(jié)合并將信號傳遞到細胞內(nèi)部，進而發(fā)揮功能。Kontogeogos等應用免疫組化和免疫定位方法在人腎上腺皮質(zhì)的束狀帶、網(wǎng)狀帶以及球狀帶區(qū)域檢測到高水平IL- 6和IL- 6受體的表達[8]。IL- 6可能通過與Y1細胞表面IL- 6受體結(jié)合成IL- 6/IL- 6R/gp130六聚體蛋白復合物，激活細胞內(nèi)的JAK/STAT途徑和Ras/MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑，影響細胞合成皮質(zhì)醇[9]。但有研究[6]結(jié)果顯示，IL- 6是通過花生四烯酸代謝途徑調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)細胞的類固醇激素分泌功能。

本研究結(jié)果提示，IL- 6聯(lián)合ACTH可明顯促進Y1細胞合成皮質(zhì)醇，分析其原因可能是：(1) ACTH可促進離體的牛腎上腺皮質(zhì)細胞分泌IL- 6[10]。本研究中ACTH聯(lián)合IL- 6處理Y1細胞時可能促進Y1細胞分泌IL- 6或表達IL- 6R。(2) ACTH通過與腎上腺細胞表面受體結(jié)合后，在Ca2+調(diào)節(jié)下激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)產(chǎn)生第二信使環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)，進一步激活蛋白激酶(Protein Kinase，PKA)信號轉(zhuǎn)導途徑，影響腎上腺細胞分泌類固醇激素[11]。曾有學者推測，ACTH與IL- 6之間可能存在關(guān)于cAMP的信號串擾，共同促進腎上腺皮質(zhì)細胞合成皮質(zhì)醇。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，IL- 6通過花生四烯酸環(huán)氧酶途徑促進ACTH刺激狀態(tài)下的腎上腺皮質(zhì)細胞合成皮質(zhì)醇，而非ACTH依賴的cAMP途徑。

細胞因子與其受體結(jié)合后啟動復雜的細胞內(nèi)分子間的相互作用，最終引起細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的變化。Koldzic- Zivanovic等通過對Y1細胞中StAR以及上游的膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450scc(cholesterol side- chain cleavage enzyme P450scc，CYP11A1)和3β- HSD的檢測發(fā)現(xiàn)，IL- 10通過與ACTH共同作用來抑制上述蛋白的合成[12]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，IL- 6單獨或聯(lián)合ACTH處理Y1細胞后，StAR mRNA的表達水平上升，提示IL- 6可單獨或聯(lián)合ACTH通過促進StAR mRNA表達增強Y1細胞合成皮質(zhì)醇的能力。目前，有關(guān)IL- 6對StAR mRNA表達的影響機制尚不明確。影響StAR mRNA表達的因素主要有cAMP- PKA信號通路、蛋白激酶C、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、類固醇合成因子- 1、X染色體基因- 1、妊娠特異性β- 1糖蛋白、類固醇誘導蛋白等[13]。在類固醇合成細胞中，AA從細胞器釋放是類固醇合成所必需的。許多研究結(jié)果顯示，AA與IL- 6關(guān)系密切，如AA可進一步誘導缺氧狀態(tài)下的小鼠胚胎干細胞分泌IL- 6[14]；IL- 6促進體外血小板活化的機制包括AA誘導途徑[15]等。有報道，IL- 6通過AA代謝途徑調(diào)節(jié)腎上腺細胞分泌皮質(zhì)醇激素。研究顯示IL- 6通過抑制磷脂酶A2的活性，使AA代謝受阻，進一步使StAR蛋白表達受到抑制而影響類固醇激素的合成[16]，并且StAR蛋白表達受阻出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平[17]，有可能是通過降低轉(zhuǎn)錄活性或mRNA的穩(wěn)定性實現(xiàn)的。因此，推測IL- 6對StAR mRNA表達的影響可能通過花生四烯酸脂氧酶代謝途徑進行。探討IL- 6與ACTH共同影響StAR表達機制的文獻比較少，是否通過促進cAMP誘導作用或花生四烯酸代謝途徑以及其他可能的調(diào)節(jié)途徑，這需要進一步研究。

近些年來，腎上腺皮質(zhì)功能的損害在內(nèi)毒素休克發(fā)生發(fā)展中的作用已逐漸成為研究熱點。腎上腺皮質(zhì)功能狀態(tài)對內(nèi)毒素休克的治療和預后評估非常重要，而IL- 6是內(nèi)毒素休克發(fā)生過程中重要的細胞因子。本研究結(jié)果表明，IL- 6與腎上腺皮質(zhì)細胞功能密切相關(guān)。因此，深入探討IL- 6對腎上腺皮質(zhì)功能的影響及其機制將為臨床治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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