司立博 田 輝 亓 磊 岳韋名 李 林 李樹(shù)海 高 存 田 煜

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科，山東 濟(jì)南 250012)

Th17細(xì)胞(Th17)是不同于Th1、Th2細(xì)胞的CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)的新亞群，其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用〔1〕，并通過(guò)分泌白細(xì)胞介素(IL)-17A/F、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子參與多個(gè)重要生理病理進(jìn)程。近年來(lái)Th17細(xì)胞在腫瘤發(fā)生中的作用引起了廣泛的關(guān)注。孤獨(dú)核受體γt (RORγt)是Th17細(xì)胞分化調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在Th17細(xì)胞的分化發(fā)育及調(diào)控IL-17分泌的過(guò)程中起著重要作用〔2～7〕。Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子是IL-17，已有研究表明在多種腫瘤中如胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、卵巢癌中均可檢測(cè)到Th17細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄因子RORγt及IL-17的高表達(dá)〔8～10〕。在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)動(dòng)物腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)IL-17可促進(jìn)腫瘤新生血管的發(fā)生，利于腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移〔11〕。在本課題中，通過(guò)檢測(cè)NSCLC患者與健康對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt和細(xì)胞因子IL-17的水平，從細(xì)胞和分子水平探討Th17細(xì)胞在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料及標(biāo)本 選取2010年10月至2011年10月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科行肺癌切除加系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)的NSCLC患者的術(shù)前外周血。所有病例均經(jīng)病理學(xué)確診，NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織(WHO)2004年的肺腫瘤組織學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，其中鱗癌23例，腺癌28例；術(shù)后病理分期參照國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)2009年的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ期20例。共有51例患者納入本研究，其中男36例、女15例，年齡31～81(60±9.34)歲，所有患者均無(wú)免疫性疾病及其他腫瘤病史，術(shù)前均未行抗腫瘤治療和免疫治療。健康對(duì)照組26例，全部為健康志愿者，其中男14例、女12例，年齡25～65(51±7.82)歲。術(shù)前取外周血5 ml，肝素鈉抗凝。所有受試者均簽署知情同意書(shū)，并報(bào)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑 FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD4抗體和PE標(biāo)記的小鼠抗人IL-17抗體均購(gòu)自eBioscience公司。Trizol試劑：購(gòu)自Invitrogen公司。IL-17的ELISA試劑盒：購(gòu)自上海遠(yuǎn)達(dá)晶美生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離與培養(yǎng)及血漿的分離 取實(shí)驗(yàn)組和健康對(duì)照組肝素抗凝外周靜脈血5 ml于無(wú)菌試管中,用等量PBS稀釋后，緩慢加入含淋巴細(xì)胞分離液的50 ml離心管中(淋巴細(xì)胞分離液：血液為1∶2)，2 500 r/min離心20 min，吸取中間層單個(gè)核細(xì)胞，用3 ml PBS洗滌2遍后即為PBMCs。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例 于PBMCs細(xì)胞懸液中加入10 μl FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD4抗體，置4℃避光孵育30 min。用PBS洗滌后，再加入100 μl固定劑振蕩混勻，于室溫孵育15 min。加入100 μl破膜劑和10 μl PE標(biāo)記的抗IL-17抗體，室溫孵育30 min；以PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果采用CellQuest軟件進(jìn)行分析。Th17細(xì)胞的水平以CD4+IL-17+細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分率表示。

1.5RT-PCR檢測(cè)PBMC中IL-17及RORγt mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑，酚-氯仿法提PBMCs的總RNA，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作獲得cDNA。PCR引物(β-actin為內(nèi)參基因)由Primer5.0軟件設(shè)計(jì)并由濟(jì)南博尚公司合成(序列見(jiàn)表1)。實(shí)時(shí)定量PCR以SYBR Green為熒光染料，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)。目的基因的表達(dá)量通過(guò)2△Ct與內(nèi)參基因?qū)Ρ?△Ct=Ct目的基因/Ct內(nèi)參基因)。PCR程序設(shè)置如下 ：95℃ 10 min解鏈，95℃ 15 s 62 ℃ 1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

1.6ELISA法檢測(cè)外周血漿中IL-17的含量 采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定。具體操作按照IL-17的ELISA檢測(cè)試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

表1 IL-17、RORγt及β-actin引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 結(jié) 果

2.1NSCLC患者外周血中Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例升高 NSCLC患者外周血Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例為(2.78±0.59)%，顯著高于健康對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞所占比例(0.59±0.15)%(P<0.01)。

2.2RT-PCR檢測(cè)PBMC中IL-17及RORγt mRNA的表達(dá)水平 與管家基因β-actin相比，IL-17的相對(duì)表達(dá)量在NSCLC患者為1.767±0.32；轉(zhuǎn)錄因子RORγt的相對(duì)表達(dá)量在NSCLC患者為2.312±0.28，與健康對(duì)照組(1.000)相比差異顯著(P<0.01)。

2.3外周血漿中IL-17含量的測(cè)定 NSCLC患者血漿中IL-17的含量為(2.14±0.23) μg/L,而健康對(duì)照組為(1.13±0.22) μg/L， 兩組比較差異顯著(P<0.001)。因此，NSCLC患者外周血血漿中Th17細(xì)胞分泌的IL-17明顯高于健康對(duì)照組。

2.4不同病理分型及TNM分期NSCLC患者之間的比較 鱗癌患者、腺癌患者外周血中Th17細(xì)胞比例、IL-17 mRNA表達(dá)水平及外周血漿中IL-17的表達(dá)水平比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；Ⅲ期患者外周血中Th17細(xì)胞比例、IL-17 mRNA表達(dá)水平及外周血漿中IL-17的表達(dá)水平較Ⅰ～Ⅱ期患者顯著增高，見(jiàn)表2。

表2 不同臨床病理特征患者Th17及相關(guān)因子變化±s)

3 討 論

人體抗腫瘤機(jī)制主要是細(xì)胞免疫，同樣肺癌的發(fā)生、發(fā)展與免疫功能狀態(tài)也密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起著重要作用，CD4+T細(xì)胞作為T(mén)細(xì)胞的重要成分，參與機(jī)體免疫應(yīng)答的各個(gè)階段，并且在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Th17 細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞的新亞群，在先天性免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要功能，并通過(guò)分泌IL-17A/F等細(xì)胞因子參與腫瘤發(fā)病的多個(gè)重要生理或病理進(jìn)程。

在多種腫瘤如胃癌〔8〕、結(jié)腸癌〔9〕、肝細(xì)胞癌〔10〕及食管癌〔11〕中均可檢測(cè)到Th17 細(xì)胞及其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt及主要效應(yīng)因子IL-17的高表達(dá)，提示Th17細(xì)胞可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。Numasaki等[12]研究NSCLC小鼠模型發(fā)現(xiàn)IL-17可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及內(nèi)皮細(xì)胞索的形成，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞或腫瘤內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞分泌多種促血管生成的細(xì)胞因子,如VEGF、TGF-β、PGE2、MIP-2、趨化因子等,從而促進(jìn)腫瘤新生血管的發(fā)生，利于腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。

本文結(jié)果表明NSCLC細(xì)胞存在Th17細(xì)胞高表達(dá)現(xiàn)象。NSCLC患者IL-17及RORγt mRNA的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，表明CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化增多。NSCLC患者外周血中IL-17含量增多，表明NSCLC患者Th17細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-17增多，并可能通過(guò)其參與NSCLC的發(fā)生。這些均說(shuō)明NSCLC患者體內(nèi)Th17及其相關(guān)因子高表達(dá)，抑制Th17的高表達(dá)有可能成為治療NSCLC的新靶點(diǎn)。

目前尚無(wú)直接證據(jù)證明IL-17與NSCLC的病理類(lèi)型和臨床分期相關(guān)。但研究〔13〕發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞與NSCLC的病理分期存在著一定的關(guān)系，隨后進(jìn)一步分析IL-17 mRNA及外周血漿中IL-17在兩組間的表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示，IL-17 mRNA的表達(dá)水平及IL-17的含量在Ⅲ期患者顯著增高。在細(xì)胞、基因、蛋白3個(gè)水平均反映了IL-17的表達(dá)隨著NSCLC的進(jìn)展而表達(dá)上調(diào)，提示Th17 細(xì)胞參與了NSCLC的增殖、浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展以及浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，我們可以嘗試通過(guò)對(duì)Th17細(xì)胞的干預(yù)調(diào)控，為臨床治療提供理論依據(jù)和新的途徑，從而有助于為腫瘤的免疫治療尋找新策略。

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