張毅敏 程少冰 聲 鑫 江書婷 戴求福

(暨南大學(xué)，廣東 廣州 510632)

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后神經(jīng)功能修復(fù)〔1〕，直接關(guān)系到患者的預(yù)后與生存質(zhì)量。目前利用神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)顱腦損傷已成為國內(nèi)外生物及醫(yī)學(xué)研究的熱點〔2〕。臨床資料表明，針刺對顱腦損傷患者催醒及神經(jīng)功能恢復(fù)有顯著的療效〔3〕。本研究采用腦挫傷大鼠動物模型，觀察針刺對顱腦損傷模型大鼠神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)的影響，探討針刺促進(jìn)顱腦損傷后神經(jīng)再生、治療TBI的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠共30只，體重(280±30)g，鼠齡42 d，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：0067955。本實驗在廣州中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物實驗室完成。

1.2藥品及主要試劑 NGF、BDNF免疫組化檢測試劑盒(德國寶靈曼公司產(chǎn)品，購自武漢博士德生物工程有限公司)。針具為 “華佗牌”一次性26號、1寸針灸針。

1.3主要儀器 RM2025切片機(jī)(自LEICA公司)、EG1140H包埋機(jī)。Olympus BX50F-3雙目顯微鏡(附件自動照相裝置Nikon E990，日本產(chǎn))。計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(GM-2000B生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) 北京航空航天大學(xué)出品)。

1.4動物造模及分組 所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，針刺組，每組10只。所有大鼠稱重后腹腔注射10 g/L的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉成功后參照自由落體沖擊造模法〔4〕：沿顱骨正中線縱行切開頭皮，分離至顱骨，于矢狀縫左旁2 mm，冠狀縫后2 mm處，用牙科鉆鉆開顱骨，以此為中心，用蚊式血管鉗咬開直徑約4 mm圓形骨窗，深度至硬腦膜，保持硬腦膜完整。模型針刺組用致傷力度為25 g小錘從25 cm高度自由落下，打擊置于硬腦膜上的直徑為3 mm的圓柱體，造成左側(cè)大腦皮質(zhì)局限性腦挫裂傷，然后將動物縫合頭皮。假手術(shù)組鉆孔后不打擊，直接縫合頭皮。各組在相同條件下喂養(yǎng)。針刺組造模后24 h內(nèi)開始治療。針刺組穴位：百會、人中、風(fēng)府透啞門、合谷。將針刺入穴位2 mm，采用捻轉(zhuǎn)平補(bǔ)平瀉手法，每穴操作2 min，每天治療1次，共治療7次。假手術(shù)組及模型組不做治療，各組在相同條件下喂養(yǎng)。治療結(jié)束當(dāng)天取材，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，斷頭取腦，4%中性多聚甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，沿挫傷灶中心作冠狀切片，片厚4 μm。

1.5免疫組化法測NGF、BDNF 各組實驗大鼠腦組織切片經(jīng)純二甲苯脫蠟二次，每次6 min；梯度乙醇脫二甲苯各2 min；自來水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min，加3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下作用10 min；切片放入已沸騰的檸檬酸修復(fù)液中，繼續(xù)加熱至溶液冒小氣泡但不沸騰為度，保持10 min；停止加熱，冷卻至室溫約25 min，流水沖洗，PBS液洗兩次，擦干切片組織周圍表面水分劃隔離圈；加入5%BSA封閉液，室溫下作用20 min；吸去血清，不洗分別直接滴加入對應(yīng)的(濃度1∶100)稀釋的第一抗體兔抗(NGF、BDNF)100 μl/片，取1張切片滴加PBS做陰性對照，37℃恒溫箱內(nèi)1 h；PBS沖洗，3 min×3次，滴加羊抗兔生物素化二抗，100 μl/片，37℃恒溫箱內(nèi)20 min；PBS沖洗，3 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素100 μl/片，37℃恒溫箱內(nèi)20 min；PBS洗后滴加入DAB顯色液100 μl/片，顯色3～5 min；蘇木素淺復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、分析結(jié)果。注意： 操作過程中組織必須保持在濕潤狀態(tài)，不能干燥； 所加試劑以完全覆蓋組織為度。免疫組化結(jié)果判斷：由病理?？漆t(yī)生在未知實驗分組情況下對所有標(biāo)本進(jìn)行分析。每張切片在10×20倍光鏡下隨機(jī)觀察每一組動物同一部位切片，選擇5個不重復(fù)視野進(jìn)行觀察，并連接全自動圖像分析系統(tǒng)，測出每張切片內(nèi)腦組織NGF、BDNF染色平均光密度和染色面積率。陽性物質(zhì)在胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色細(xì)顆粒狀，細(xì)胞核為淺藍(lán)色，陰性對照為陰性。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及T3法檢驗。

2 結(jié) 果

2.1針刺對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織NGF表達(dá)的影響 模型組大鼠NGF平均光密度與陽性面積率較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)；針刺組較模型組明顯升高(P<0.01)。見表1，圖1。

表1 針刺對腦損傷大鼠大腦皮質(zhì)NGF、BDNF表達(dá)的影響±s，n=10)

2.2針刺對腦挫傷大鼠腦組織BDNF表達(dá)的影響 模型組大鼠BDNF平均光密度與陽性面積率較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)；針刺組較模型組明顯升高(P<0.01)。見表1，圖2。

圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)NGF蛋白表達(dá)(SABC，×200)

圖2 各組大鼠大腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達(dá)(DAB，×200)

3 討 論

神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化依賴于各種生長因子的協(xié)同作用和不同信號的相互作用，神經(jīng)營養(yǎng)因子是指一系列與神經(jīng)元存活、神經(jīng)軸突生長相關(guān)的小分子蛋白。研究顯示其生理作用不僅涉及神經(jīng)元存活、增殖、分化和誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長，還參與認(rèn)知記憶過程中神經(jīng)元之間的連接，而且對損傷后的神經(jīng)再生有促進(jìn)作用〔5〕。神經(jīng)干細(xì)胞必須在神經(jīng)營養(yǎng)因子的存在下才能存活和不斷增殖〔6〕，其中以NGF和BDNF的作用最為重要。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可合成NGF，顱腦損傷后NGF可誘導(dǎo)軸突定向生長，促進(jìn)神經(jīng)元的有絲分裂與分化，修復(fù)和再生神經(jīng)的血管形成，阻止神經(jīng)元繼發(fā)性損害，支持神經(jīng)元存活，改善神經(jīng)系統(tǒng)功能〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，在重型TBI嬰兒腦室內(nèi)連續(xù)注射NGF可明顯改善腦功能，減少腦軟化灶，同時檢測到標(biāo)志神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)母細(xì)胞遷移的微管相關(guān)蛋白(DCX)表達(dá)增加〔8〕，NGF和復(fù)合介導(dǎo)途徑可使更多軸突通過損傷區(qū)生長〔9〕。向大鼠腦室注入NGF 抗體，可使皮質(zhì)神經(jīng)元死亡增加，皮質(zhì)變薄，情感和認(rèn)知功能明顯受損〔10〕。 重型顱腦損傷后，NGF在神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制中起重要作用。腦脊液中NGF濃度是損傷嚴(yán)重程度的標(biāo)志，48 h內(nèi)高濃度的NGF與IL-6伴 IL-1β低表達(dá)，預(yù)示著預(yù)后良好〔11，12〕。目前NGF已成為治療TBI的熱點之一〔8〕。

BDNF屬神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF家族，在大腦神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中均可合成，不僅具有神經(jīng)元保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化和再生功能，還對大腦損傷后腦功能恢復(fù)起重要作用〔13〕。體外培養(yǎng)證明BDNF能促進(jìn)海馬祖細(xì)胞增殖，并向神經(jīng)元方向轉(zhuǎn)化〔14〕。 Henry等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，BDNF可通過作用于內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞來增強(qiáng)神經(jīng)再生功能。有學(xué)者提出尋找簡單方便高效的方法來增加內(nèi)源性BDNF的表達(dá)來治療腦損傷，并可把BDNF表達(dá)量的變化作為療效指標(biāo)之一〔13〕。研究表明，常規(guī)治療配合針刺有助于提高急性腦梗死患者腦源性 BDNF、NGF的表達(dá)，促進(jìn)患者神經(jīng)功能的康復(fù)〔16〕。

本研究表明針刺能上調(diào)神經(jīng)再生相關(guān)因子NGF、BDNF的表達(dá)、加速損傷腦組織修復(fù)。我們的前期研究結(jié)論“針刺可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化”、“縮小腦損傷面積”也證明了這一點〔17〕。本實驗提示：針刺可促進(jìn)神經(jīng)再生相關(guān)營養(yǎng)因子NGF、BDNF的表達(dá)、這可能是針刺促進(jìn)顱腦損傷后神經(jīng)再生與神經(jīng)功能恢復(fù)、治療TBI的機(jī)制之一。

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