何 敏 舍雅莉 侯 茜 郭 美 王 嵐 張 帆

(甘肅中醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所 中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

中藥黨參是我國常用的傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，其藥理學(xué)功能有延緩衰老，抗氧化，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，影響免疫器官的重量，調(diào)控細(xì)胞因子，降低血脂，調(diào)節(jié)體液免疫，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，影響單核巨噬細(xì)胞，促進(jìn)造血功能等〔1，2〕。有研究表明甘肅黨參水提物可能通過提高機(jī)體免疫功能,清除衰老機(jī)體產(chǎn)生過多的自由基，抗脂質(zhì)過氧化而起到延緩衰老的作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)研究甘肅黨參水煎劑對D-半乳糖致衰老小鼠脾臟細(xì)胞抗氧化和DNA損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小鼠60只，雄性，體重(20±2)g，SPF級，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2藥品與試劑與儀器 黨參：素花黨參(甘肅文縣產(chǎn)，由甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系靳玲副教授鑒定)，制成含生藥濃度為1 g/ml的水煎劑,置4℃?zhèn)溆谩-半乳糖：上海中秦有限公司(批號：20120104)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號：分別為A 001-1、A 005、A 002南京建成生物工程研究所提供)。PI染液、正常熔點(diǎn)瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖，1%月桂酸肌氨酸鈉、蛋白酶K、Tris、均購自美國Sigma公司；Na2EDTA購自瑞士Fluka &RDH 公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Feb-80臺式高速離心機(jī)：金壇市恒豐儀器廠；756 MC型分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；水浴箱(ZHWY-110X30)，電泳槽和電泳儀：(BIO-RAD)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS-IX51)。

1.3方法 60只小鼠，隨機(jī)分為正常組，模型組，黨參低劑量、高劑量組，維生素E組，每組12只。正常組皮下注射0.9%生理鹽水0.25 ml/10 g，其余各組每日頸背部皮下注射5%D-半乳糖0.25 ml/10 g，連續(xù)注射10 d。于第11天開始(每天繼續(xù)注射D-半乳糖)黨參低、高劑量組每日給予黨參水煎劑5，15 g/kg灌胃，正常組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，維生素E組每日維生素E 50 mg/kg灌胃，再連續(xù)給藥32 d。

1.4脾臟組織SOD、GSH-Px、MDA測定 于末次給藥的次日，頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，稱體重，脾臟組織加9倍體積的冰生理鹽水，制成10%脾臟組織勻漿，然后(3 000～4 000)r/min離心10 min，取適量上清液采用黃嘌呤氧化酶法測定脾臟組織中總SOD活性，用5,5，-二硫?qū)?-硝基苯甲酸(DTNB)法測定GSH-Px的活力，硫代巴比妥酸法檢測脾臟組織中MDA活性，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5脾細(xì)胞懸液的制備 頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取脾臟組織放于含適量冰冷的PBS的平皿內(nèi)，用眼科剪剪成糜狀(約1 mm3組織塊)，200目尼龍網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濾液1 600 r/min離心5 min，用PBS重新懸浮離心管低的細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度。用4%的臺盼藍(lán)排斥法檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞存活率接近90%，細(xì)胞密度為105～106個/ml。細(xì)胞吹打均勻后，向每個2.0 ml的離心管中各加400 μl脾細(xì)胞，在37℃水浴中孵育60 min。

1.6單細(xì)胞凝膠電泳 鋪第一層膠：常規(guī)載玻片打磨，自來水清洗，泡酸過夜，自來水，雙蒸水清洗烘干備用。取50 ℃以上，1%的正常熔點(diǎn)的膠50 μl/片給備好的磨片鋪第一層膠備用。鋪第二層膠：取孵育好的細(xì)胞和40℃、1.2 ml 1%的低熔點(diǎn)的膠各400 μl吹打均勻放在37℃水浴箱水浴，將上述兩種液體各取1.4 ml，制成混懸液均勻的鋪在備好的膠片上，室溫下靜止3～4 min。裂解：將凝膠浸入4℃預(yù)冷的裂解液中，放在4℃冰箱1 h后移入37℃、CO2培養(yǎng)箱過夜。電泳：從裂解液中移出載玻片，用pH 8.5的TBE漂洗3次，每次30 min，在第3次漂洗時將4℃預(yù)冷的TBE加入電泳槽，靜止20～30 min后，將漂洗好的玻片移入電泳槽里，隨后在相同電泳液中以電壓25 V，電流300 mA，室溫避光條件下電泳30 min。固定：電泳完成后取出玻片移入暗盒，加1%的H2O2固定10 min后，用蒸餾水漂洗3次，每次3 min。染色：用5 μg/ml PI染液染色30 min，雙蒸水洗掉表面的染料，24 h內(nèi)在倒置熒光顯微鏡20倍物鏡下進(jìn)行觀察，照相，激光波長488 nm。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1甘肅黨參水煎劑對脾臟細(xì)胞的抗氧化作用 模型組小鼠SOD、GSH-Px活性顯著低于正常組(P<0.01)。甘肅黨參水煎劑高劑量組、維生素E組與模型組相比SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.01，P<0.05),MDA含量顯著降低(P<0.01)。黨參低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2甘肅黨參水煎劑對脾臟細(xì)胞DNA損傷的影響 模型組小鼠脾細(xì)胞的尾距和尾部DNA含量顯著高于正常組(P<0.01)。甘肅黨參水煎劑高劑量組、低劑量組、維生素E組與模型組相比小鼠脾細(xì)胞的尾距和尾部DNA含量顯著降低(P<0.01)，見表1。

表1 甘肅黨參水煎劑對D-半乳糖致衰老小鼠脾臟組織SOD、GSH-Px活性、MDA含量及脾臟細(xì)胞DNA損傷的影響(n=12,±s)

3 討 論

機(jī)體衰老的分子機(jī)制包括諸多因素,而自由基的損傷在衰老機(jī)制的研究中占有一定的地位。機(jī)體自由基學(xué)說認(rèn)為引起人體衰老的主要原因是人體細(xì)胞代謝過程中不斷產(chǎn)生自由基，自由基在體內(nèi)積累過多，過剩的自由基就會使類脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，從而破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使膜功能失常，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時脂質(zhì)過氧化過程的延伸階段產(chǎn)生脂過氧自由基LOO·、脂氧自由基LO·、和脂自由基L·、終止階段產(chǎn)生的小分子丙二醛等，均可對DNA造成損傷〔4〕，有資料表明：DNA隨年齡的增長，損傷增加，修復(fù)能力減弱〔5〕，引發(fā)DNA損傷的因素很多，DNA分子在環(huán)境中的X線、紫外線、化學(xué)藥品等及體內(nèi)自由基等因素作用下均可受到損傷。而體內(nèi)氧化-還原反應(yīng)的代謝產(chǎn)物氧自由基(OH)就是其中主要因素之一。因此，尋找能清除氧自由基，并能保護(hù)DNA損傷的有效物質(zhì)，以保護(hù)DNA雙鏈完整性，防止基因突變，亦是現(xiàn)在延緩衰老以及防治某些疾病特別是防治腫瘤中一個新的研究方向。

單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(SCGE) 或稱彗星試驗(yàn)〔6，7〕，是一種直接在熒光顯微鏡下用肉眼觀察單個細(xì)胞DNA鏈斷裂的試驗(yàn)方法。在堿處理和堿性電泳的作用下DNA解螺旋,使DNA的斷鏈和堿易變性DNA片段從嚴(yán)密的超螺旋結(jié)構(gòu)中釋放出來；由于這些DNA斷鏈分子量小且堿變性為單鏈，所以在電泳電場中就可以離開核DNA在凝膠分子篩中向陽極移動，產(chǎn)生一個尾狀帶，未損傷的DNA部分保持球形，二者共同形成“彗星”。在一定范圍內(nèi)，“彗星”的長度(代表DNA遷移距離)和經(jīng)熒光染色后“彗星”熒光強(qiáng)度(代表DNA的量)與DNA損傷程度相關(guān)，這樣就可以定量檢測單個細(xì)胞中的DNA損傷〔8，9〕，進(jìn)而反映整個細(xì)胞、組織、器官內(nèi)DNA整體損傷程度的大小。

D-半乳糖連續(xù)誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠模型較為公認(rèn)，可以用于行為學(xué)、抗氧化以及免疫學(xué)等方面的抗衰老藥物藥效的研究〔10～12〕。本實(shí)驗(yàn)研究說明甘肅素花黨參水煎劑能使衰老小鼠脾臟細(xì)胞SOD，GSH-Px活力增強(qiáng)，MDA含量降低，并且有效減少DNA的損傷。因此，甘肅素花黨參水煎劑能增強(qiáng)D-半乳糖致衰老小鼠脾臟細(xì)胞抗氧化能力及保護(hù)DNA的作用。

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