董瑩瑩 李 威

(遼寧省婦幼保健院婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110005)

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，它介導(dǎo)的下游多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理過程，包括細(xì)胞的增生、分化、凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt參與了細(xì)胞的正常生理活性的調(diào)節(jié)，且只在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化時表達(dá)是增加的，其過度表達(dá)對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用〔1～3〕，但是，在宮頸癌的病理過程中，PI3K/Akt能否通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的凋亡過程尚不清楚，需進(jìn)一步研究。本研究采用Western 印跡和RT-PCR方法，檢測經(jīng)不同濃度的PI3K抑制劑(LY-294002)處理的人宮頸癌細(xì)胞株的Bcl-2的表達(dá)變化，探討PI3K在宮頸癌的病理作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞所；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司；PI3K抑制劑LY294002購自碧云天生物技術(shù)研究所，分子量307.3；鼠抗人單克隆Bcl-2購于美國Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Hela細(xì)胞置于37 ℃，飽和濕度，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)消化傳代。以含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的培養(yǎng)液RPMI-1640培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每2～3 d傳代1次。取生長狀態(tài)穩(wěn)定，呈對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3實驗分組 實驗使用細(xì)胞均為接種24 h后處于對數(shù)生長期細(xì)胞，分為對照組和LY294002干預(yù)組，干預(yù)組再細(xì)分為4個亞組，分別以終濃度為 5、10、20、40 μmol/L 的PI3K抑制劑LY294002處理人宮頸癌Hela細(xì)胞，作用48 h。

1.4Western印跡方法檢測各實驗組Bcl-2蛋白的表達(dá) 用蛋白裂解液RIPA(50 mmol/L Tris-base、1.0 mmol/L EDTA、150 mmol/NaCl、 0.1%SDS、1%TritonX-100、1% Sodium deoxycholate)及蛋白酶抑制劑(USA)提取細(xì)胞蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法，測定蛋白濃度，計算加樣量。加入樣品緩沖液，沸水浴中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性，制備12%分離膠，4%濃縮膠，電泳，5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4 ℃過夜。一抗鼠抗人單克隆Bcl-2、β-actin (1∶200) 室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG-HRP (1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜后， ECL發(fā)光，暗室曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，計算出各組樣品鼠抗人單克隆Bcl-2目標(biāo)帶的光密度值與內(nèi)參照β-actin 光密度值的比值。

1.5RT-PCR方法檢測各實驗組Bcl-2 mRNA的表達(dá) 按照Trizol(Gibco，USA)劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行總mRNA提取，然后以逆轉(zhuǎn)錄(RT法)先合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴增；Bcl-2的上、下游引物分別為：上游5′-TGAGTTCGGTGGGGTCAT-3′；下游為：5′-GGAGAAATCAAACAGAGGC-3′，擴增產(chǎn)物全長187 bp。β-actin的上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物為：5′- GCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′，擴增產(chǎn)物全長374 bp。擴增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進(jìn)行圖像分析。以目的基因與β-actin光密度的比值代表目的基因的相對表達(dá)含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Western 印跡檢測Bcl-2蛋白表達(dá) 對照組宮頸癌細(xì)胞株有大量的Bcl-2陽性表達(dá)(0.43)，在以終濃度為 5 μmol/L的LY294002處理48 h后，宮頸癌細(xì)胞株的Bcl-2陽性表達(dá)迅速降低(0.32)，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，而且隨著LY294002終濃度的升高，宮頸癌細(xì)胞株的Bcl-2陽性表達(dá)也隨之降低(0.25，0.23，0.2)。見圖1。

1～5：對照組、5、10、20、40 μmol/L LY294002干預(yù)組，下圖同

2.2RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA表達(dá) Bcl-2 mRNA在對照組宮頸癌細(xì)胞株即有大量的表達(dá)(0.8)，與對照組相比在經(jīng)終濃度為5 μmol/L的LY294002處理后，實驗組宮頸癌細(xì)胞株的Bcl-2 mRNA的表達(dá)迅速降低(0.5，P<0.05)，而且隨著處理宮頸癌細(xì)胞株的抑制劑LY294002終濃度的升高，實驗組宮頸癌細(xì)胞株的Bcl-2 mRNA的表達(dá)也隨之降低(0.4，0.35，0.3)。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA表達(dá)

3 討 論

PI3K是由催化亞單位(p110)和調(diào)節(jié)亞單位(PIK3R1)組成的異源二聚體，PI3K負(fù)責(zé)下游作用底物磷酸磷脂酰肌醇肌醇環(huán)上的3＇羥基進(jìn)行磷酸化，從而使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)變?yōu)?，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，這是許多細(xì)胞外生長因子刺激的關(guān)鍵活化步驟。磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶B(P13K/Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于細(xì)胞中，對細(xì)胞的生存起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用〔4〕。P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過以下幾種機制發(fā)揮抗凋亡調(diào)節(jié)作用：①下調(diào)R-RAS信號通路，抑制細(xì)胞凋亡〔5〕；②Akt磷酸化凋亡前體蛋白BAD，抑制其促凋亡作用，并促進(jìn)Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用③ARt通過激活NF-kB信號通路，促進(jìn)細(xì)胞存活〔6〕；④通過下調(diào)p53蛋白表達(dá)，阻斷P53介導(dǎo)的促凋亡轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；⑤誘導(dǎo)c-fos轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗凋亡作用；⑥磷酸化forkhead蛋白，阻止其發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄功能〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞的生長，侵襲轉(zhuǎn)移凋亡和血管形成等，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔8～10〕，研究發(fā)現(xiàn)，P13K蛋白的高表達(dá)和Akt蛋白的高表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性，但是，在宮頸癌的病理過程中，PI3K/Akt參與腫瘤細(xì)胞的凋亡過程尚不十分清楚〔11〕。

Bcl-2家族在調(diào)節(jié)線粒體途徑中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，家族中的抗凋亡蛋白成員包括Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1等。促凋亡蛋白包括Bax、Bik、Bad和僅有BH3結(jié)構(gòu)域的Bid、Bim、PUMA等BH3蛋白。這些蛋白多定位于細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)上，尤其是線粒體膜上。Bcl-2是線粒體凋亡通路中主要的調(diào)節(jié)蛋白， 其作用是抑制Caspase的激活底物， 如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，抑制細(xì)胞凋亡，其在腫瘤細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2基因表達(dá)下降，同時伴隨Bax、Bad等促凋亡基因表達(dá)的上調(diào)〔12～14〕，但是，在宮頸癌的病理過程中，PI3K/Akt能否通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的凋亡過程尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示上調(diào)Bcl-2的表達(dá)可能是PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一。

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