趙 剛 王偉民 楊 帥 羅貴聰 劉曉燕 鐘世鎮(zhèn)

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510010)

缺血再灌注對(duì)組織的影響主要是缺血后恢復(fù)血液供應(yīng)造成的過(guò)量的自由基攻擊，從而引起組織細(xì)胞損害〔1，2〕。目前有學(xué)者認(rèn)為腦缺血再灌注損傷的核心病理環(huán)節(jié)是氧化應(yīng)激、自由基連鎖反應(yīng)?？寡趸委熂白杂苫宄穷A(yù)防腦缺血再灌注損傷的重要治療措施。白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，有清除自由基、抗氧化的效果，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)更有保護(hù)作用，但是其作用機(jī)制仍無(wú)定論〔3,4〕。本研究觀察白藜蘆醇對(duì)腦缺血再灌注損傷后各指標(biāo)的影響，從而探討其保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠64只，體重(250 ± 30)g，分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組，低劑量組及高劑量組四組，每組16只，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2試劑 白藜蘆醇(德寶生化公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，德寶生化公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，水合氯醛(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型復(fù)制 假手術(shù)組分離大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)外動(dòng)脈不插線；腦缺血再灌注組復(fù)制模型但不給藥。低劑量組和高劑量組手術(shù)前連續(xù)7 d經(jīng)腹腔給藥，1次/d；術(shù)前30 min給藥1次，共8次。低劑量組的給藥劑量為15 mg/kg，高劑量組為30 mg/kg。模型復(fù)制采用改良線栓法：魚(yú)線(進(jìn)口，直徑0.23～0.26 mm，長(zhǎng)4.0 cm)，乙醇消毒，離頭部2 cm處做黑色標(biāo)記，置于生理鹽水中備用。大鼠術(shù)前禁食12 h，采用腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，固定，頸部正中切口，分離右側(cè)的頸總動(dòng)脈(結(jié)扎近心端)、頸內(nèi)動(dòng)脈(近端備線，遠(yuǎn)端放置動(dòng)脈夾)、頸外動(dòng)脈(結(jié)扎遠(yuǎn)心端)及翼鄂動(dòng)脈(不結(jié)扎)，于頸總動(dòng)脈分叉膨大處做切口，松開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾并向其內(nèi)插入魚(yú)線(18～20 mm)，稍感阻力后結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，固定魚(yú)線(留10 mm線頭在外面方便抽出)，縫合皮膚。2 h后抽出線栓使血流重新灌注。白熾燈加熱維持術(shù)后大鼠體溫，蘇醒后放回鼠籠，自由飲食。

1.3.2神經(jīng)功能缺損評(píng)分 術(shù)后24 h進(jìn)行評(píng)分：0分為正常無(wú)神經(jīng)性障礙；1分為動(dòng)物左前肢不能隨意伸張；2分為左側(cè)肢體癱瘓，走路時(shí)向左轉(zhuǎn)圈，出血追尾現(xiàn)象；3分為行走時(shí)左側(cè)跌倒不能站立或打滾；4分為有意識(shí)障礙無(wú)自發(fā)活動(dòng)。其中0分和4分的大鼠均為模型復(fù)制失敗，應(yīng)被剔除，剔除后在后續(xù)試驗(yàn)中隨機(jī)補(bǔ)充，保證每組大鼠數(shù)目不變。

1.3.3MDA含量及SOD活性測(cè)定 術(shù)后24 h采集各組大鼠尾靜脈血1 ml及損傷側(cè)的大腦皮質(zhì)及海馬組織，加入冰生理鹽水制成腦組織勻漿，3 000 r/min離心靜脈血及勻漿液5 min，取上清液分別采用化學(xué)比色法測(cè)定兩者的含量，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4腦梗死體積測(cè)定 術(shù)后24 h斷頭取腦，于-20℃速凍15 min后取出，去除嗅腦、低位腦干及小腦，冠狀位切成6等分，均放入2%TTC溶液中，37℃避光，孵育30 min，4%多聚甲醛固定拍照后，小心分離白色和紅色組織，分別稱重，計(jì)算腦梗死體積：腦梗死體積(%)= 蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量+非蒼白區(qū)重量)×100%。

1.3.5腦組織含水量測(cè)定 術(shù)后24 h斷頭取腦，用濾紙小心擦拭缺血側(cè)腦組織表面水分，稱其濕重，然后置于100℃烤箱內(nèi)烘至恒重，稱其干重，計(jì)算腦組織含水量：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及腦組織含水量比較 功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及腦組織含水量由高到低排列依次為腦缺血灌注組、低劑量組、高劑量組與假手術(shù)組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬及血清中MDA及SOD含量比較 與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組大腦皮質(zhì)、海馬及血清內(nèi)的MDA含量明顯升高，SOD活性明顯下降(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，低劑量組及高劑量組的MDA含量明顯升高，SOD活性明顯下降(P<0.05)；與腦缺血再灌注組比較，低劑量組及高劑量組的MDA含量下降，SOD活性上升，高劑量組變化更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組肺組織病理改變及排斥等級(jí)±s,n=15)

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬及血清中MDA含量及SOD含量比較±s,n=15)

3 討 論

腦組織對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感，易受缺血再灌注氧化損傷〔5〕。腦缺血再灌注損傷時(shí)活性氧大量生成，抗氧化酶失活，抗氧化劑消耗使活性氧不能及時(shí)清除，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)平衡被打破，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，SOD、MDA等自由基損傷的指標(biāo)與其密切相關(guān)〔2, 6～8〕。因此，清除體內(nèi)的氧自由基含量，降低MDA水平、提高SOD活性有助于預(yù)防腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷。白藜蘆醇是一種天然的清除自由基的化合物，預(yù)防性給予白藜蘆醇可使機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷，但是臨床對(duì)于其清除自由基抗氧化的機(jī)制并不是特別清楚〔9〕。

本次研究說(shuō)明腦缺血再灌注后會(huì)造成神經(jīng)功能障礙、腦梗死等，而且預(yù)防性給予白藜蘆醇能降低神經(jīng)功能障礙及腦梗死程度，劑量越高，保護(hù)作用越強(qiáng)〔10〕。MDA 是一種氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度；SOD是機(jī)體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，使生物體免受自由基的攻擊，通常用其活性高低評(píng)價(jià)機(jī)體清除氧自由基的能力〔11〕。本研究結(jié)果提示白藜蘆醇對(duì)腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)機(jī)制可能是降低MDA含量，提高SOD活性。

4 參考文獻(xiàn)

1袁 野,楊俊卿,周岐新.腦缺血再灌注致小鼠神經(jīng)元退行性變進(jìn)程中自由基水平和SOD-1表達(dá)的變化〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2011;33(12):1211-5.

2Zheng JM,Chen XC,Lin M,etal.Mechanism of the reduction of cerebral ischemic-reperfusion injury through inhibiting the activity of NF-kappaB by propyl gallate〔J〕.Yao Xue Xue Bao,2011;46(2):158-64.

3李 萍,杜洪霞,李新華,等.白黎蘆醇對(duì)高脂血癥大鼠血脂、血小板聚集、釋放功能的影響〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010;26(5):502-3.

4李碧俠,趙 芳,任守文,等.白黎蘆醇誘導(dǎo)的去乙?；窼IRT1高表達(dá)對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國(guó)畜牧雜志,2013;49(3):69-71, 80.

5陳 靜,呂瑩瑩,徐舒敏,等.大蒜素對(duì)腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的改善作用〔J〕.血栓與止血學(xué),2012;18(5):217-20.

6Peng B, Guo QL, He ZJ,etal.Remote ischemic postconditioning protects the brain from global cerebral ischemia/reperfusion injury by up-regulating endothelial nitric oxide synthase through the PI3K/Akt pathway〔J〕.Brain Res,2012;1445:92-102.

7Sun J,Tong L,Luan Q,etal.Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2012;32(5):851-9.

8Tuma RF, Steffens S.Targeting the endocannabinod system to limit myocardial and cerebral ischemic and reperfusion injury〔J〕.Curr Pharm Biotechnol,2012;13(1):46-58.

9劉月強(qiáng),趙素貞,孟凡民,等.單次低劑量丙泊酚聯(lián)合肢體缺血后處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012;47(2):259-61.

10任俊偉,楊 琴.白藜蘆醇對(duì)大鼠腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷的影響〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2011;24(3):292-6.

11Yang J, Li J, Lu J,etal.Synergistic protective effect of astragaloside IV-tetramethylpyrazine against cerebral ischemic-reperfusion injury induced by transient focal ischemia〔J〕.J Ethnopharmacol,2012;140(1):64-72.