方慧云 程偉民 李曉玲 季明芳

大腸癌(colorectal cancer，CRC)包括結(jié)腸癌和直腸癌，是常見的消化道惡性腫瘤之一，全世界大腸癌的發(fā)病率處于惡性腫瘤的第三位[1-2]。目前主要是手術(shù)、放療和化療，但是這些方法對于晚期患者效果并不理想。隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，CIK細胞過繼免疫治療已成為腫瘤治療的第四模式。本研究是將CIK細胞行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，回輸患者體內(nèi)，并隨機抽出30例未行CIK治療的晚期大腸癌患者，進行比較，觀察其療效。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集經(jīng)確診的、并發(fā)生轉(zhuǎn)移的、且采用標準治療方案(手術(shù)、放療和化療)治療的晚期大腸癌患者作為觀察組(30例)，取其外周血分離單個核細胞(PBMC)，體外細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細胞，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞表型，30例患者均接受CIK細胞免疫治療，觀察其免疫活性、無進展生存期及生存期。以30例僅采用標準治療方案而未經(jīng)CIK治療的晚期大腸癌患者作為對照組。兩組性別、年齡無顯著差異。

1.2 試劑

GT-T551無血清培養(yǎng)基購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)用IL-2、CD3McAb、IL-1、IFN-γ均為R&D公司產(chǎn)品，流式細胞儀標記抗體CD3、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+為BeckmanCoulter產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)

CIK細胞的體外誘導(dǎo)和擴增：采集患者外周血50ml，用淋巴細胞分離液(Ficoll)分離出PBMNC，GT-T551無血清培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度為(4 - 6 )×106/ml，并加入1 000 U /ml的IFN-γ懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)液15 ml，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入1 μg/ml的CD3單克隆抗體和1 000 U /ml的IL-1，48 h后補加液至50 ml，補充CD3單克隆抗體。第4天繼續(xù)補加液至80 ml，培養(yǎng)第5天分成3瓶，第7天轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋，每2天加液1次，液量為500 ml。

1.4 流式細胞儀檢測

待細胞培養(yǎng)15天后，應(yīng)用流式細胞儀檢測CIK細胞表面分子，CIK細胞是以CD3、CD4、CD8細胞為主的異質(zhì)性細胞，CD3 和CD8細胞百分率隨培養(yǎng)時間的延長而增高，CD3分辨率>80%，CD3+CD56+分辨率>20%。

1.5 治療方法

細胞培養(yǎng)第15天開始回輸患者體內(nèi)，細胞分5次回輸，細胞總量不少于1010。輸注過程中要嚴格按照無菌操作程序，沖洗輸液管道的鹽水量不必太多，輸前口服消炎痛，出現(xiàn)發(fā)熱寒戰(zhàn)等癥狀應(yīng)停止回輸，并采取應(yīng)對措施。

1.6 免疫指標的檢測

觀察組患者在治療前后檢測外周血T淋巴細胞亞群(CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+，CD3+CD56+)和NK細胞(CD56+)變化。

1.7 毒性反應(yīng)監(jiān)測

觀察組患者在每次治療后6 h內(nèi)觀察包括(過敏反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)等急性毒性反應(yīng))；每2周檢查患者血常規(guī)、肝腎功能，以觀察治療的慢性毒性反應(yīng)。

1.8 隨訪項目

觀察兩組患者無進展生存期及生存期。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 CIK細胞回輸后不良反應(yīng)

3例患者有輕度畏寒、發(fā)熱等癥狀，體溫37.5～38 ℃，一般回輸1～2 h后出現(xiàn)，歷時2～6 h，可自限性。

2.2 CIK細胞治療后外周血T淋巴細胞亞群及NK細胞變化

CIK細胞治療后，發(fā)現(xiàn)CD3+、CD3+CD4+、CD56+(NK)效應(yīng)細胞的比率和CD4+/ CD8+比值顯著上升，而CD3+CD56+效應(yīng)細胞的比率下降，見表1。

表1 CIK細胞治療前后T淋巴細胞亞群及NK細胞水平

2.3 預(yù)后

觀察組發(fā)生轉(zhuǎn)移后無進展生存期為(50.9±10.8)個月，對照組無進展生存期為(26±8.3)個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

觀察組發(fā)生轉(zhuǎn)移后生存期為(62.5±13.8)個月，對照組為(35.6±10.2)個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

我國大腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尤其是結(jié)腸癌的發(fā)病率迅速上升。大多數(shù)患者就診時已達中晚期，采用標準治療方案已沒有明顯效果。CIK細胞是1種新型的免疫活性細胞。它是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細胞[3-4]，具有增值速度快、殺瘤譜廣、殺瘤活性高等優(yōu)點；配合化療、放療，可提高腫瘤患者對放化療的耐受性，提高腫瘤的治療效果；晚期腫瘤患者單純采用CIK治療，可以消除、減小腫瘤，提高免疫力和患者生存率以及生活質(zhì)量。

CIK細胞是多種細胞因子共同誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞，多種細胞因子的作用是相互協(xié)同，單一薪資對效應(yīng)細胞的增殖及細胞毒活性小于多種細胞因子的聯(lián)合作用。抗CD3單克隆抗體(CD3McAb)作為1種有絲分裂促進劑可促進細胞增殖，具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。γ-干擾素(IFN-γ)可通過多種途徑直接或間接發(fā)揮抗腫瘤作用。在誘導(dǎo)CIK細胞形成過程中加入IFN-γ可降低IL-2用量，且先加入IFN-γ后加入IL-1可提高細胞毒活性，因為先加入IFN-γ可促使PBMC上IL-2受

體數(shù)量增加，從而有效地激活效應(yīng)細胞。白細胞介素-1(IL-1)主要由激活的單核巨噬細胞產(chǎn)生，它可以介導(dǎo)外周單個核細胞上表達IL-2受體，與IFN-γ、CD3McAb合用時可以明顯提高CIK的細胞毒效應(yīng)，但IL-1對CIK擴增不起作用[5]。白細胞介素-2(IL-2)是T淋巴細胞分泌的1種細胞因子，具有免疫增強、抗腫瘤和抗感染的作用。

CIK細胞殺傷靶細胞的機制：與靶細胞的結(jié)合階段，通過靶細胞表面分子和效應(yīng)細胞表面的受體相結(jié)合；致死性打擊階段，CIK細胞激活后釋放毒性顆粒和分泌細胞因子，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的裂解；靶細胞溶解階段。本研究結(jié)果顯示，30例晚期大腸癌患者通過CIK 治療后，免疫功能增強，無進展生存期及生存期延長。目前，晚期大腸癌患者在接受標準治療后，聯(lián)合細胞免疫治療，可緩解病情，改善患者的生存質(zhì)量，提高生存率。

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[3] 應(yīng)敏剛，魏植強，楊建偉，等.結(jié)直腸癌術(shù)后放化療聯(lián)合DC-CIK的療效分析〔J〕.實用癌癥雜志，2010，25(3)： 274-276，282.

[4] Nagaraj S，Ziske C，Schmidt-Wolf IG.Human cytokine-induced killer cells have enhanced in vitro cytolytic activity via non-viral interleukin-2 gene transfer〔J〕.Genet Vaccines Ther，2004，2(1)：12.

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