程甜甜 楊賢子 駱志國

MCM2屬于微小染色體維持蛋白家族(minichromosome maintenance proteins，MCMs)的成員之一。MCM2蛋白與其他家族成員形成復(fù)制前復(fù)合物可作為DNA復(fù)制的“通行證”，在所有真核細(xì)胞的DNA復(fù)制中起到重要作用[1]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)MCM2作為細(xì)胞增殖特異性標(biāo)志優(yōu)于常見的細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67，能夠更客觀和全面的反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)[2]。本研究通過檢測乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

所有標(biāo)本隨機(jī)取自2012年03月1日-2013年05月1日湖北省十堰市太和醫(yī)院乳腺外科住院患者的手術(shù)切除組織。全組病例均經(jīng)病理檢查確診，其中乳腺惡性腫瘤54例，乳腺良性疾病12例，以乳腺良性疾病手術(shù)切除的正常乳腺組織(10例)作為對照組。54例乳腺惡性腫瘤包括35例浸潤性導(dǎo)管癌、6例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、2例乳腺小葉原位癌、3例髓樣癌、5例單純癌、其他3例。其中Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例。12例乳腺良性疾病包括乳腺纖維腺瘤、乳腺腺病、乳腺囊性小葉增生，患者術(shù)前均未行放療、化療、激素和中草藥物等治療。手術(shù)標(biāo)本于-80℃凍存。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測不同乳腺癌組織MCM2mRNA的表達(dá)

所有PCR引物均用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，引物序列由上海生工生物工程公司合成。MCM2引物序列上游：5’-CACGCTTTGACATCCTGTG-3’；下游：5’-TGTTGATCTGACGAGCCTTA-3’，PCR產(chǎn)物大小為657 bp。GAPDH引物序列上游：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’；引物下游：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’，PCR產(chǎn)物大小為113 bp。分別稱取0.1 g的正常乳腺組織、乳腺良性疾病組織和乳腺癌組織，用勻漿器將組織碾磨碎后按照Trizol試劑(MRCGENE公司)說明書提取組織總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度和濃度。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis成套試劑盒(MBI Fermentas公司)操作合成cDNA。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)。取10 μl的擴(kuò)增產(chǎn)物在EB染色的2%瓊脂糖凝膠中電泳。用凝膠成像掃描分析系統(tǒng)(英國Syngene公司的GeneGenius)測定所有條帶，應(yīng)用GeneTools軟件分析所有條帶各自峰面積值,定義為該條帶的吸光度值(OD)。以GAPDH為內(nèi)參照基因，MCM2基因mRNA的相對表達(dá)量則用MCM2基因(T)與內(nèi)參照基因(C)吸光度值的比率(T/C OD ratio)表示。MCM2基因mRNA檢測經(jīng)歷3次獨(dú)立性重復(fù)檢測。

1.3 Western blotting檢測MCM2蛋白的表達(dá)

用總蛋白提取試劑盒(Applygen公司)提取所有標(biāo)本的總蛋白。簡而言之，將0.1 g的所有標(biāo)本剪碎后加入1 ml裂解液，然后放入勻漿器將組織碾磨均勻。取0.5 ml組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管。每0.5 ml組織勻漿液加入2倍體積的(1 ml)抽提試劑充分混勻。室溫或4 ℃靜置10 min后，4℃下10 000 r/min離心10 min，棄去上下層液體，無水乙醇洗滌中層蛋白膜后溶于4℅ SDS，使用BCA法蛋白含量測定試劑盒(Pierce,Rockford,IL,USA)檢測提取的蛋白濃度。取等量的蛋白(25 μg)上樣于12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后加入抗MCM2的一抗(美國Santa Cruz公司，按1∶300稀釋)在4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，用DAB試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司)顯影。MCM2蛋白檢測經(jīng)歷3次獨(dú)立的重復(fù)性檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(independent sample t-test)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05判定差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 正常乳腺組織和良、惡性乳腺腫瘤組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達(dá)

與正常的乳腺組織相比，良、惡性乳腺腫瘤組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均增高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。RT-PCR和Western-blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，良性和惡性乳腺腫瘤組織之間MCM2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平也存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.2 MCM2表達(dá)與乳腺癌組織臨床分期的關(guān)系

由圖1和圖2中可以看出，不同TNM分期的乳腺癌組織中MCM2表達(dá)存在著差異。其中Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌組織MCM2 mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的乳腺癌組織(P<0.05)，見表1。而Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅳ期乳腺癌組織間MCM2的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

1為Marker；2為H2O對照；3為正常乳腺組織；4為乳腺良性疾病組織；5為Ⅰ期乳腺癌組織；6為Ⅱ期乳腺癌組織；7為Ⅲ期乳腺癌組織；8為Ⅳ期乳腺癌組織。

1為正常乳腺組織；2為乳腺良性疾病組織；3為Ⅰ期乳腺癌組織；4為Ⅱ期乳腺癌組織；5為Ⅲ期乳腺癌組織；6為Ⅳ期乳腺癌組織。

表1 不同TNM分期乳腺癌組織中MCM2基因mRNA的相對表達(dá)量(M±SD)

注：mRNA相對表達(dá)量為目的基因光密度(OD)與GAPDH光密度(OD)之比率。

2.3 MCM2表達(dá)與乳腺癌組織臨床病理特征的關(guān)系

由圖3和圖4可見，低、中、高分化乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達(dá)量存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。其中，低分化乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達(dá)量較高分化的增高(P<0.01)，見表2和圖4。

表2 不同分化程度乳腺癌組織中MCM2基因mRNA的相對表達(dá)量(M±SD)

注：mRNA相對表達(dá)量為目的基因光密度(OD)與GAPDH光密度(OD)之比率。

1為Marker；2為H2O對照；3為正常乳腺組織；4為乳腺良性疾病組織；5為高分化乳腺癌組織；6為中分化乳腺癌組織；7為低分化乳腺癌組織。

1為正常乳腺組織；2為乳腺良性疾病組織；3為低分化乳腺癌組織；4為中分化乳腺癌組織；5為高分化乳腺癌組織。

3 討論

2012年中國腫瘤登記中心發(fā)布最新數(shù)據(jù)指出乳腺癌是我國女性排名第一位的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尤其是在城市。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，雖然我國乳腺癌的治愈率和5年生存率明顯提高，但乳腺癌的早期診斷仍不理想。因早期的腫瘤細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，故腫瘤的早期診斷主要通過對其相關(guān)的增殖標(biāo)志物來判斷。目前臨床上常用的乳腺癌增殖標(biāo)志物包括PCNA、Ki-67等。MCM蛋白家族是真核生物DNA復(fù)制的必需因子，在DNA復(fù)制起始和延伸過程中起到關(guān)鍵性作用[3]。Osaki等研究發(fā)現(xiàn)：與常用的增殖指標(biāo)PCNA和Ki-67蛋白相比，MCM2蛋白能夠更敏感而更特異地反映細(xì)胞的增殖情況[4]。隨后國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，MCM2蛋白能夠較好的區(qū)分正常組織、不典型增生組織和腫瘤組織，可以作為結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞肝癌、食管癌、乳腺癌等惡性腫瘤的重要生物學(xué)標(biāo)志，在判斷腫瘤的惡性度及評估預(yù)后方面具有重要意義[2,5-7]。

我們前期使用免疫組化S-P法，得出MCM2在乳腺癌中的表達(dá)主要在細(xì)胞核內(nèi)。MCM2在乳腺癌不同TNM分期、不同病理組織學(xué)分級(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間均有顯著性差異，且呈逐漸升高趨勢。MCM2和Ki-67在乳腺癌中的表達(dá)呈平行關(guān)系(P<0.001)，且作用優(yōu)于Ki-67[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCM2在乳腺癌mRNA和蛋白水平的表達(dá)均較高，這與我們在免疫組化中得到的結(jié)果一致。這一現(xiàn)象提示MCM2的表達(dá)過量可能導(dǎo)致正常乳腺細(xì)胞不斷進(jìn)入細(xì)胞周期，反復(fù)啟動DNA復(fù)制和延伸，從而使DNA突變率增加，最終導(dǎo)致乳腺細(xì)胞發(fā)生癌變。同時，MCM2 mRNA和蛋白的表達(dá)量在乳腺癌不同的TNM分期和不同的病理類型之間存在著統(tǒng)計學(xué)的差異(P<0.05)，但在Ⅰ期和Ⅱ期之間、Ⅲ期和Ⅳ期之間MCM2的表達(dá)卻無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。這提示MCM2可能對反映乳腺癌細(xì)胞惡性程度和異常分化有重要的參考價值，從而可用來判斷臨床治療和預(yù)后評估等。

本研究結(jié)果從mRNA和蛋白表達(dá)水平上再次證實MCM2可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對癌前病變、惡性程度及預(yù)后判定具有一定的臨床意義。進(jìn)一步深入研究MCM2表達(dá)調(diào)控在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，可能找到預(yù)防和治療乳腺癌的方法。MCM2可能成為乳腺癌基因治療一個新的潛在分子靶點(diǎn)。

[1] Labib K,Tercero JA,Diffley JF.Uninterrupted MCM2-7 fun-

ction required for DNA replication fork progression〔J〕.Science,2000,288(5471):1643-1647.

[2] 程甜甜,楊賢子,謝 偉,等.MCM2在乳腺癌的表達(dá)及其意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009,17(4):653-655.

[3] Takisawa H,Mimura S,Kubota Y.Eukaryotic DNA replication:from pre-replication complex to initiation complex 〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2000,12(6):690-696.

[4] Osaki M,Yamashita H,Shomori K,et al.Expression of MC-

M2 in human malignant fibrous histiocytomas:Correlations with Ki-67 and P53 expression and apoptosis 〔J〕.Int J Mol Med,2002,10(2):161-168.

[5] Hanna-Morris A,Badvie S,Cohen P,et al.Minichromosome maintenance protein 2 (MCM2) is a stronger discriminator of increased proliferation in mucosa adjacent to colorectal cancer than Ki-67〔J〕.J Clin Pathol,2009,62(4):325-330.

[6] 王曉林,熊枝繁,曹仕瓊,等.肝細(xì)胞肝癌組織MCM2和FAP-1表達(dá)及其與癌細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)性研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2011,18(3):205-207.

[7] 陶玉梅,陶儀聲,馬 莉.食管鱗狀細(xì)胞癌中MCM2蛋白與Ki-67的表達(dá)及對比研究〔J〕.臨床與實驗病理學(xué)雜，2011,27(4):382-384.