嚴璞，呂強

（1.北京天壇醫(yī)院泌尿外科，北京100050；2.江蘇省人民醫(yī)院，江蘇南京210029）

4HPR對人膀胱移行上皮癌細胞T24表面分子E-Cad表達的影響

嚴璞1，呂強2

（1.北京天壇醫(yī)院泌尿外科，北京100050；2.江蘇省人民醫(yī)院，江蘇南京210029）

目的檢測4HPR對膀胱上皮細胞T24細胞表面分子E-Cad表達的影響，研究其是否能通過調(diào)節(jié)該分子表達從而降低腫瘤細胞的浸潤性。方法培養(yǎng)膀胱上皮細胞T24細胞，利用MTT方法確定合理的藥物處理濃度，提取細胞全蛋白、mRNA，分別采用Western blot和RT-PCR檢測E-Cad表達。采用免疫熒光試驗檢測藥物處理前后E-Cad表達量的變化及β-Cat表達位置變化。結(jié)果采用10μM的4HPR處理T24細胞48 h后，E-Cad基因mRNA和蛋白較對照組均明顯增加；同時β-Cat表達位置也由細胞核轉(zhuǎn)向細胞質(zhì)，位于細胞膜內(nèi)側(cè)。結(jié)論4HPR可使T24細胞E-Cad基因表達增加，其可能通過調(diào)節(jié)E-Cad的表達，實現(xiàn)其降低腫瘤細胞的浸潤性，而起到預防、治療癌癥的目的。

4HPR；E-Cad；T24細胞；浸潤性

N-4-羥苯維甲酰胺（N-4-hydroxyphenylretinamide，4HPR）是一種人工合成的維生素A的類似物，與大多數(shù)類維A物質(zhì)一樣，在體內(nèi)外對包括乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌在內(nèi)的多種癌細胞具有生長抑制、誘導凋亡、降低浸潤等作用［1-2］。此外，由于其具低肝毒的特點，使其比其它類維A物質(zhì)更具應用前景，也更受研究者的關(guān)注［3-5］。研究顯示，4HPR可以通過神經(jīng)酰胺、活性氧（ROS）以及caspase-3等途徑誘導細胞凋亡，但對于其降低癌細胞的浸潤力的研究較少［6］。E-鈣粘素（epithelial cadherin，ECad）是一種跨膜糖蛋白，幾乎表達于所有的正常上皮細胞，它的主要作用是在Ca2＋存在的條件下胞外結(jié)構(gòu)域與相鄰同型細胞胞外結(jié)構(gòu)域形成同源二聚體結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)部分通過連環(huán)素與肌動蛋白骨架結(jié)合，維持同型細胞間黏附。腫瘤細胞浸潤有一個從原發(fā)位置脫落，轉(zhuǎn)移至新的位置的過程，這個過程與E-Cad表達量減少以及血管形成有關(guān)［7-9］。臨床病理標本研究也顯示，許多腫瘤包括尿路上皮癌患者的腫瘤組織都表現(xiàn)出E-Cad與β-連環(huán)素的表達異常及其復合物的破壞［10-11］。據(jù)此，我們推測4HPR可能是通過增加E-Cad的表達來降低癌細胞浸潤力的，增加同型細胞間的相互粘連，從而降低其浸潤性，起到預防、治療癌癥的目的。本實驗中，本研究以膀胱上皮癌細胞T24為對象，檢測4HPR處理前后E-Cad表達水平及β-Cat表達位置的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器：Steri-Cycle細胞培養(yǎng)箱，Jouan；bkf離心機，湘儀；6f74冷凍離心機，effendorf；1499電泳槽，北京六一；BIO-RAD轉(zhuǎn)膜儀，北京六一；WD-9408C電泳儀，Tanon；IX73倒置顯微鏡，Olympus；共聚焦熒光顯微鏡DMLA（CW4000，Leica Germany）；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-RAD；ECL顯色檢測系統(tǒng)法國Vilber公司。

1.1.2 細胞實驗所用細胞：實驗所用T24細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，中國武漢）。

1.1.3 試劑RIPA裂解液（強）、彩色蛋白預染Marker、ECL顯色試劑盒均購自北京碧云天公司；β-Cat兔抗人多克隆抗體、β-actin鼠抗人抗體購自SANTA CRUZ公司；E-Cad鼠抗人單克隆抗體購自美國ABcam公司；Alexa Fluor 488標記羊抗鼠、AlexaFluor 594標記鹿抗兔購自antGene公司；4HPR購自Sigma公司；瓊脂糖購自BIOWEST公司；cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒購自Fermentas公司；RNA（Trizol）提取試劑購自Invitrogen公司；PCR DNA Ladder購自GenScript公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑及配制：1640培養(yǎng)基：購自杭州吉諾液體1640培養(yǎng)基（由Gibco原粉配制），胎牛血清購自Hyclone，臨用時加入胎牛血清至終濃度10%和抗生素至終濃度1%，4℃保存。

pH 7.2的PBS溶液（0.01 mol／L）：NaCl 8.0 g，KC1 0.2 g，Na2HP041.42 g，KH2P040.24 g，加雙蒸水溶解，定容至1000mL，15磅高壓滅菌后，4℃保存。

5×蛋白電泳緩沖液：稱取Tris-base 15.1 g，SDS 5 g、甘氨酸94 g溶于800mL雙蒸水中，最后定容至1 L，室溫保存。

5×loading buffer：稱取1M Tris-HC1（pH 6.8）1.25mL，SDS 0.5 g，溟酚藍25 mg和甘油2.5 m L，最后定容至5 mL，小份（500μL／份）分裝，于室溫保存，在用之前，每500μL需加入25μLβ-巰基乙醇。

0.25 %胰酶C（0.02%EDTA）：用10M HCl調(diào)pH至7.7，過濾除菌分裝，然后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10%AP（過硫酸按）：1 g AP溶于10mL ddH2O中，－20℃保存1周。

10%SDS：1 g SDS溶于10mL ddH2O中，室溫保存。

5%封閉緩沖液：2.5 g脫脂奶粉溶于50mL PBS中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1M Tris-HCl（pH 6.8）：在燒杯中加入1 L ddH2O，加入Tris 121.1 g，在量筒中定容至1 L，用濃鹽酸調(diào)PH至6.8，高壓后室溫保存。

1.5 M Tris-HC1（pH 8.8）：在燒杯中加入1 L ddH2O，加入Tris 181.7 g，在量筒中定容至1 L，用濃鹽酸調(diào)PH值至8.8，高壓后室溫保存。

30%丙烯酞胺：在燒杯中加入1 L ddH2O，丙烯酞胺290 g，BIS（亞甲基甲叉雙丙烯酞胺）10 g，定容至1 L，用濾器濾去雜質(zhì)，于棕色瓶中4℃保存。

考馬斯亮藍8250：8250 0.25 g，甲醇50mL，冰乙酸40mL，加水到100mL。

脫色液：乙酸50mL，甲醇225mL，ddH20 500mL。

10×轉(zhuǎn)膜緩沖液：Tris 29 g，甘氨酸14.5 g，SDS 1.85 g，加水到500mL。用時取10mL，加20mL甲醇，加70mL雙蒸水。

洗膜液：10×PBS 50mL，450mL ddH2O，0.5mL Tween-20。

1.2.2 T24細胞的培養(yǎng)：準備1支10mL離心管，并加入4mL完全1640培養(yǎng)基。從液氮取出凍存的T24細胞，立即38℃水浴使其快速解凍，然后轉(zhuǎn)移到準備好的10mL離心管中，1000 r／min離心5min，棄上清，向離心管中加4mL完全1640培養(yǎng)基，重懸后轉(zhuǎn)移到25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 MTT實驗測量各孔的吸光值：胰酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整其濃度至（5～10）×104個／mL；將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入1.25、2.5、5、10、20、40μM 4HPR，每孔100μL，設(shè)5個復孔。5%CO237℃孵育48 h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。每孔加入10μLMTT溶液（5mg／mL，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)，準備溶解結(jié)晶。將上清去掉，每孔加入150μL二甲基亞颯，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀波長570 nm處測量各孔的吸光值。

1.2.4 Western blot檢測E-Cad表達量的變化：配制聚丙烯酞胺凝膠（10%分離膠和5%濃縮膠）；濃縮膠完全凝固后，拔掉梳子，倒入電泳液至長短玻璃之間1／2處（約125 mL，注意外漏），外槽倒入約250mL電泳緩沖液。每孔上樣20μL樣本，每面膠取左邊第一孔加入3μL蛋白Marker；電泳濃縮膠恒壓90 V，分離膠恒壓130 V，電泳至溟酚蘭剛跑出即可終止電泳。根據(jù)Maker條帶把膜剪開，分別用PBST配制的一抗4℃孵育過夜（大于10 h），抗體濃度抗說明書推薦濃度配制，并根據(jù)結(jié)果適當調(diào)整。去掉一抗，PBST洗3次，每次10min。加入PBST配制的二抗，室溫孵育2 h。去二抗，PBST洗4次，每次10 min。ECL孵育：取A，B液各500μL，混合后均勻涂在膜上，等1min后進行曝光顯色。

1.2.5 RT-PCR：引物設(shè)計如下：E-Cad：正義鏈：5′-TCCATTTCTTGGTCTACGCC-3′，反義鏈：5′-CACCTTCAGCCAACCTGTTT-3′。試劑盒中GAPDH引物序列如下：正義鏈：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，反義鏈：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

cDNA第一條鏈合成：準備無RNase的PCR管（200μL）置于冰上：按下列順序和劑量加入試劑：模板RNA 5μL；Oligo（dT）18 1μL；無RNase水6μL；5×Reaction Buffer 4μL；RiboLockTMRNase Inhabitor 1μL；10mM dNTP Mix 2μL；M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL搖勻、離心；42℃，60min孵育；70℃，5min終止反應；－70℃長期保存。PCR：按如下劑量加入試劑（于冰上）：10×Taq buffer 5.0μL；2mM dNTP mix 5.0μL；Primer I 0.5μL；Primer II 0.5μL；Taq DNA Polymersae 1.0μL；25 mM MgCl24.0μL；Template cDNA 2.0μL；ddH2O 32μL；混勻，離心按以下程序進行PCR 95℃起始變性3 min 1次；95℃變性30 s 30次；56℃退火30 s30次；72℃延伸30 s30次；72℃終止7min 1次；GAPDH退火溫度為58℃。

1.2.6 細胞免疫熒光：取對數(shù)生長細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。將細胞接種到預先放置有6mm×22 mm蓋玻片（用多聚賴氨酸處理過，使細胞貼壁更牢固，以防脫片）的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，37℃5%CO2培養(yǎng)1～3 d，待細胞接近長成單層，取出蓋玻片，用PBS洗3次，然后4%的多聚甲醛室溫固定20min。固定后可開始免疫熒光步驟；用槍吸掉封閉液，立即滴加稀釋好的一抗（E-Cad單克隆抗體1∶50和β-Cat多克隆抗體，1∶50），4℃孵育過夜，注意保持樣品的濕潤；回收一抗，用PBS洗滌3次，每次5min；滴加稀釋好的熒光二抗（1∶200），室溫孵育1～2 h，此操作需要避光，孵育過程中也要在避光條件下進行；回收二抗，用PBS洗滌3次，每次5min；50%甘油封片，立即在熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡（Leica）下觀察染色情況，以免熒光淬滅。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度4HPR對T24細胞的影響 采用MTT法確定合適的藥物劑量（作用時間為48 h），選擇使藥物即可以有效作用于細胞，又不至于誘導其發(fā)生凋亡的濃度用于下游實驗。利用GraphPad Prism 5.0軟件進行直方繪制及統(tǒng)計學分析。故而選用10μM 4HPR來進行下面的實驗。

圖1 MTT結(jié)果直方圖Fig.1 The results of MTT histogram

2.2 Western blot檢測E-Cad表達量的變化 如圖2，結(jié)果顯示：對照組E-Cad不表達，4HPR處理組表達量明顯增加，說明4HPR對E-Cad的表達具有正向調(diào)節(jié)作用。

圖2 Western blot實驗結(jié)果Fig.2 Western blot results

2.3 4HPR對E-Cad基因表達影響 從圖中可以看出，用10μM的4HPR處理T24細胞48 h之后，與DMSO對照組相比，E-Cad基因在mRNA水平上表達量也有明顯增加。說明4HPR對T24細胞E-C ad基因表達水平的調(diào)節(jié)是多層次。本實驗選擇GAPDH為內(nèi)參。

圖3 RT-PCR實驗結(jié)果Fig.3 The experimental results of RT-PCR1：Marker；2，3：處理組；4，5：DMSO對照組；6～9：內(nèi)參，分別對應組2～5；10～13：陰性對照；14：陽性對照1：Marker；2，3：treatment group；4，5：DMSO control group；6～9：as a control respectively corresponding to group 2～5；10～13：a negative control group；14：a positive control

2.4 細胞免疫熒光 通過免疫熒光技術(shù)檢測E-Cad表達量的變化及β-Cat表達位置的變化來判斷4HPR對細胞的調(diào)控效果。選用發(fā)綠色熒光的二抗標記E-Cad和紅色熒光二抗標記β-Cat。由結(jié)果看出，對照組E-Cad幾乎不表達，此時β-Cat主要位于細胞核內(nèi)；與此對應的，經(jīng)4HPR處理后，E-Cad表達量明顯增加，β-Cat的表達位置也由細胞核轉(zhuǎn)移至細胞膜，這與理論相符。

圖4 共聚焦圖片F(xiàn)ig.4 Confocal images

3 討論

本課題研究了4HPR對人膀肌移行上皮癌細胞T24 E-Cad基因表達的影響。研究結(jié)果顯示：用10μM的4HPR處理T24細胞48 h，可以在蛋白質(zhì)及mRNA水平上觀察到E-Cad基因表達增加；另外還觀察到β-Cat表達位置發(fā)生明顯的變化，隨著E-Cad蛋白表達量的增加，其由細胞核轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中。β連環(huán)素（β-Cat）是一個92KD的蛋白，最初是被作為與E-Cad細胞質(zhì)末端相連接的蛋白被分離出來［11］。它主要的作用是介導E-Cad與β-Cat相連接，進而與細胞骨架相連，維持同型細胞間的相互粘連。細胞中正常表達的E-Cad都是以與β-Cat形成復合體的形式存在。在比較處理前后細胞形態(tài)變化時，發(fā)現(xiàn)4HPR處理后，細胞形態(tài)明顯的改變，與正常膀肌上皮癌細胞形態(tài)接近，這很可能與細胞的浸潤性降低有直接關(guān)聯(lián)。

4HPR是類維生素A家族的一個很具代表性的成員，由于其相對的低毒、組織損傷以及生物活性，闡述其作用機制具有重要的意義［12-14］。本實驗結(jié)果有力地證實了先前的推測，即4HPR至少部分是通過調(diào)節(jié)E-Cad基因的表達，促進其與β-Cat復合體形成而起到降低腫瘤細胞浸潤性的作用。但是，4HPR可以調(diào)節(jié)細胞信號通路中多種細胞因子的表達，調(diào)節(jié)部位多樣，而E-Cad基因受調(diào)控的方式也包含多種情況［15］，所以尚不能確定4HPR是通過具體的什么方式，在何種水平調(diào)節(jié)E-Cad基因表達的，有待進一步的實驗研究。

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（編校：吳茜）

Effect of 4HPR on E-Cad expression of human bladder cancer T24 cell line

YAN Pu1，LV Qiang2

（1.Department of Urology，Beijing Tian Tan Hospital，Beijing 100050，China；2.People's Hospital of Jiangsu Province，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo determine the effect of4HPR on E-Cad expression in bladder epithelial cell T24 and study whether E-Cad can be used as a indicator for reference in determining levels of cancer.MethodsT24 cellwere cultured and the reasonable concentration of4HPR were used to treat with the cells，results were determined by MTT method.The expression of E-Cad protein and mRNA were detected by Western blot and RT-PCR，separately，and the location ofβ-Cat were determined.ResultsCompared with control group，the expression of E-Cad protein and mRNA were both increased significantly in 4HPR treated groups.And the location site ofβ-Catwas changed from nucleus to the cytoplasm，next to the cellmembrane. Conclusion 4HPR could up-regulate the expression of E-Cad in T24 cells，as to reduce invasive tumor cells，and prevent cancer.

4HPR；E-Cad；T24 cell；invation

R730.2

A

1005－1678（2014）08－0006－04

國家自然科學基金（BK2011848）

嚴璞，男，學士，主治醫(yī)師，研究方向：下尿路腫瘤治療，E-mail：qch1821460071＠163.com。