高華，朱長(zhǎng)明，王濤，白利平，康向鵬，閆峰

（廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院胃腸外科，福建廈門(mén)361004）

PI3K 和MAPK抑制劑對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系GIST-T1細(xì)胞增殖和凋亡的影響

高華，朱長(zhǎng)明，王濤，白利平，康向鵬，閆峰Δ

（廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院胃腸外科，福建廈門(mén)361004）

目的研究胃間質(zhì)瘤中（磷脂酰肌醇-3-激酶）PI3K和（絲裂原活化蛋白激酶）MAPK信號(hào)通路對(duì)FOXO1的活性調(diào)節(jié)及胃間質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法采用PI3K信號(hào)通路抑制劑LY294002和MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑UO126單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響；Western blot檢測(cè)FOXO1、p-FOXO1蛋白及信號(hào)下游蛋白Bcl2、Bax表達(dá)的變化；免疫熒光法檢測(cè)FOXO1蛋白在GIST-T1細(xì)胞中的細(xì)胞定位的變化。結(jié)果與DMSO組相比，LY294002和UO126單獨(dú)、聯(lián)合處理組GIST-T1細(xì)胞增殖明顯受到抑制（P＜0.05），且呈時(shí)間依賴性。Western blot結(jié)果顯示，總FOXO1蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)顯著變化，而p-FOXO1及Bcl2蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），Bax蛋白的表達(dá)增加（P＜0.05）。免疫熒光顯示FOXO1在GIST-T1細(xì)胞中的細(xì)胞核移位明顯增多。LY294002和UO126聯(lián)合處理GIST-T1細(xì)胞較藥物單獨(dú)應(yīng)用時(shí)作用效果顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)論LY294002和UO126能夠抑制GIST-T1細(xì)胞增殖；PI3K和MAPK信號(hào)通路能通過(guò)調(diào)節(jié)FOXO1蛋白磷酸化水平，使其轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，進(jìn)而抑制Bcl2的表達(dá)，增加Bax的表達(dá)，且2種抑制劑作用效果具有協(xié)同效應(yīng)。

FOXO1；PI3K；MAPK；胃腸道間質(zhì)瘤；Bcl2；Bax

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是消化道最常見(jiàn)的間葉組織腫瘤，是一種具有惡性潛能的胃腸道腫瘤［1］。GISTs發(fā)病率約為1～2例／10萬(wàn)人口，發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)［2］。FOXO1是FoxO蛋白家族成員，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)FOXO1與細(xì)胞凋亡、DNA損傷／修復(fù)、細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激、血管生成和糖代謝等密切相關(guān)［3-5］。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI-3K）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是調(diào)節(jié)FOXO1的關(guān)鍵信號(hào)通路，F(xiàn)OXO1的靶基因與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、代謝和遷移等關(guān)系密切［6］。研究表明FOXO1因子高表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖［7］。FOXO1可以通過(guò)磷酸化、乙?；榷喾N調(diào)節(jié)方式影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但PI3K和MAPK信號(hào)通路在胃間質(zhì)瘤中對(duì)FOXO1轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究GIST-T1細(xì)胞中PI3K和MAPK信號(hào)通路對(duì)FOXO1轉(zhuǎn)錄因子活性與細(xì)胞內(nèi)定位及其下游凋亡相關(guān)因子Bcl2、Bax表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和細(xì)胞培養(yǎng) PI3K抑制劑LY294002和MAPK抑制劑UO126（Sigma Aldrich公司）；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco公司）；FOXO1抗體、p-FOXO1（s256）抗體、Bcl2抗體、Bax抗體（Cell Signaling公司）；兔抗人GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（Santa Cruze公司）；TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、CCK-8試劑盒（生工公司）；DAPI（Roche公司）。

GIST-T1細(xì)胞系（百恩維公司），以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好，呈對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 CCK-8檢測(cè)GIST-T1細(xì)胞的增殖抑制率 取GIST-T1單細(xì)胞懸液，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，血清饑餓24 h，處理組分別加入30μmol／L LY294002（LY294002組），10μmol／L UO126（UO126組），30μmol／L LY294002＋10 μmol／L UO126（即：LY＋UO組），對(duì)照組加入等量DMSO，每組5個(gè)重復(fù)孔，分別作用0、12、24、36、48h后，加入10μL CCK-8試劑，37℃孵育1 h。輕微溶解震蕩，450 nm為吸收波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)量各孔吸光度。抑制率＝（對(duì)照組OD值×實(shí)驗(yàn)組OD值）／對(duì)照組OD值×100%。

1.3 Western blot檢測(cè)FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，血清饑餓24 h后，分別加入30μmol／L LY294002（LY294002組），10μmol／L UO126（UO126組），30μmol／L LY294002＋10μmol／L UO126（即LY＋UO組），對(duì)照組加入等體積的DMSO（抑制劑溶解在DMSO中），抑制劑作用24 h后收集細(xì)胞。加入RIPA裂解液置于冰上裂解30min，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞3次，4℃，12000 r／min離心10min后取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整樣品濃度使其相同，蛋白經(jīng)10%或15% SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后以5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（稀釋倍數(shù)1∶1000）置于4℃冰箱孵育過(guò)夜，經(jīng)洗滌后，再加入HRP標(biāo)記的二抗（稀釋倍數(shù)1∶2000），室溫孵育2 h，洗滌后加入ECL顯影液顯影，自動(dòng)成像儀采集圖像后以GAPDH為內(nèi)參用Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 免疫熒光檢測(cè)FOXO1的細(xì)胞定位變化 將GIST-T1細(xì)胞以1×104個(gè)／孔的密度接種于6孔板中的玻片上，待細(xì)胞貼壁后每孔加1mL培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，血清饑餓24 h，處理組分別加入LY294002（濃度30μmol／L）、UOl26（濃度10μmol／L）、LY294002（濃度30μmol／L）和UO126（濃度10μmol／L），對(duì)照組加入等量DMSO。處理24 h后取出爬片細(xì)胞，洗滌后丙酮固定20 min，0.5%Triton-100進(jìn)行細(xì)胞通透20min，然后用1%BSA封閉30 min，加入一抗（稀釋倍數(shù)1∶1000）4℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫避光孵育2 h，洗滌后DAPI染核15 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s”表示，組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種信號(hào)通路抑制劑對(duì)GIST-T1細(xì)胞的增殖抑制作用

CCK-8結(jié)果顯示，與DMSO組相比，經(jīng)LY294002（濃度30 μmol／L）和UO126（濃度10μmol／L）分別處理的GIST-T1細(xì)胞，隨著處理時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖受抑制程度增強(qiáng)（P＜0.05）。LY＋UO組較LY294002組或UO126組細(xì)胞的增殖抑制作用更加顯著（P＜0.05），藥物作用36 h時(shí)細(xì)胞大量死亡（見(jiàn)圖1）。

圖1 單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用LY294002、UO126對(duì)胃間質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of LY294002 and UO126 alone or in combination on GIST-T1 cell proliferation

2.2 FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白表達(dá)的變化Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組相比，LY294002（濃度30 μmol／L）及UO126（濃度10μmol／L）分別或聯(lián)合處理GIST-T1細(xì)胞24h均可引起細(xì)胞中的p-FOXO1、Bcl2蛋白水平下降，Bax蛋白表達(dá)水平增加，且LY＋UO組p-FOXO1、Bcl2表達(dá)下降更為顯著，Bax蛋白表達(dá)增加更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但LY294002組、UO126組、LY＋UO組與DMSO組相比，總FOXO1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖2）。

圖2 單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用LY294002、UO126處理GIST-T1細(xì)胞后FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax的表達(dá)*P＜0.05，與DMSO組相比Fig.2 Expression of FOXO1，p-FOXO1，Bcl2 and Bax in GIST-T1 cell after treated with LY294002 and UO126 alone or in combination *P＜0.05，compared with DMSO group

2.3 FOXO1蛋白在細(xì)胞中的定位變化 免疫熒光結(jié)果顯示，DMSO組FOXO1在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中分布廣泛，LY294002（濃度30μmol／L）、UO126（濃度10μmol／L）處理GIST-T1細(xì)胞24h后，細(xì)胞漿FOXO1明顯減少，細(xì)胞核FOXO1相應(yīng)增加，且LY＋UO組FOXO1胞核移位較單獨(dú)應(yīng)用LY294002、UO126組更加明顯（見(jiàn)圖3）。

圖3 單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用LY294002、UO126處理GIST-T1細(xì)胞后FOXO1定位Fig.3 Localization of FOXO1 in GIST-T1 cell after treated with LY294002 and UO126 alone or in combination

3 討論

胃間質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡抑制關(guān)系密切，F(xiàn)OXO1是參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子。有研究指出FOXO1能夠參與調(diào)節(jié)包括Bcl2、Bax等凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，其活性受到磷酸化、乙?；刃揎椃绞秸{(diào)節(jié)［8］。而PI3K和MAPK信號(hào)通路作為FOXO1轉(zhuǎn)錄因子的重要調(diào)節(jié)通路，直接參與FOXO1的磷酸化修飾過(guò)程，進(jìn)而影響FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性及其下游靶蛋白的表達(dá)［6］。Bcl2家族是最早研究的凋亡相關(guān)基因，其中Bcl2具有抗凋亡作用，而B(niǎo)ax具有促凋亡作用，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)兩者的比例失調(diào)［9］。Bcl2過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。FOXO1因子可以通過(guò)抑制Bcl2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［11-12］。但其確切機(jī)制尚不明確，進(jìn)一步研究FOXO1對(duì)其表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制具有十分重要的意義。

有研究表明，PI3K和MAPK抑制劑能夠抑制FOXO1磷酸化，使FOXO1向細(xì)胞核移位，從而調(diào)節(jié)FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性，抑制細(xì)胞的增殖［13-15］。本研究采用GIST-T1細(xì)胞作為研究對(duì)象，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用PI3K信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑處理細(xì)胞之后，CCK-8顯示LY294002和UO126組對(duì)GIST-T1的增殖具有明顯的抑制作用，LY＋UO組抑制作用更為顯著，且呈時(shí)間依賴性。這一結(jié)果表明，PI3K信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路在GIST-T1細(xì)胞增殖中起到十分重要的作用。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，PI3K、MAPK抑制劑單獨(dú)或聯(lián)合作用24 h后，總FOXO1蛋白水平與DMSO組相比沒(méi)有明顯的變化，但磷酸化水平明顯降低，這說(shuō)明PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以通過(guò)改變FOXO1因子的磷酸化水平，影響其轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，隨著FOXO1磷酸化水平降低，Bcl2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白的表達(dá)水平表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，且聯(lián)合用藥組較單獨(dú)用藥組變化更加顯著，進(jìn)一步證實(shí)PI3K信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑能夠增強(qiáng)FOXO1因子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響其下游凋亡相關(guān)因子的表達(dá)。此外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到，GIST-T1細(xì)胞給予抑制劑處理后，F(xiàn)OXO1蛋白從細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)移位。同時(shí)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組（LY＋UO組）較單獨(dú)用藥組（LY294002組、UO126組）FOXO1蛋白胞核移位更加顯著，說(shuō)明兩種抑制劑在調(diào)節(jié)FOXO1活性方面具有一定的協(xié)同效應(yīng)。

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在胃間質(zhì)瘤細(xì)胞中，PI3K和MAPK抑制劑可以通過(guò)抑制FOXO1蛋白磷酸化水平，使FOXO1蛋白向細(xì)胞核移位，進(jìn)而抑制FOXO1因子的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致Bcl2表達(dá)降低，促進(jìn)Bax的表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以及抑制細(xì)胞增殖。上述實(shí)驗(yàn)證明PI3K信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路在胃間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的部分作用是通過(guò)調(diào)節(jié)FOXO1因子的轉(zhuǎn)錄活性，影響其下游凋亡相關(guān)因子Bcl2、Bax等的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。因此，深入研究FOXO1轉(zhuǎn)錄因子在胃間質(zhì)瘤中的作用具有重要意義，為胃間質(zhì)瘤靶向治療藥物的研發(fā)提供了新的方向。

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（編校：吳茜，王冬梅）

Influence of PI3K and MAPK inhibitors on proliferation and apoptosis of gastrointestinal stromal tumor cell line GISIT-T1

GAO Hua，ZHU Chang-ming，WANG Tao，BAILi-ping，KANG Xiang-peng，YAN FengΔ

（Department of Gastrointestinal Surgery，Zhongshan Hospital to Affiliated Xiamen University，Xiamen 361004，China）

ObjectiveTo research the regulatory mechanism of PI3K and MAPK signaling pathways on FOXO1 transcription factor activity and its inhibit effection on gastrointestinal stromal tumor cell proliferation and apoptosis.MethodsGastrointestinal stromal tumor cell line（GIST-T1）was handled alone or in combination with specific PI3K inhibitor LY294002 and MAPK inhibitor UO126.The proliferation of GIST-T1 CCK-8 was examined by CCK-8，the expression of FOXO1，p-FOXO1 Bcl2 and Bax was detected by western blot.The localization of FOXO1 was detected by Immunofluorescence（IF）.ResultsThe growth of GIST-T1 cellswas siginificantly inhibited alone or in combination with LY294002 and UO126，and dependent on duration of the illumination.Western blot showed that the expression of p-FOXO1 and Bcl2 were obvious reduced，but the expression of Bax remarkably increased alone or in combination with LY294002 and UO126 groups（P＜0.05）.Significant changewith total FOXO1 was not found，and immunofluorescence showed FOXO1 was redistributed to the nucleus.The change of protein express and localization in combined group was more remarkable than single groups.ConclusionPI3K inhibitor LY294002 and MAPK inhibitor UO126 can inhibit GIST－T1 cell proliferation.PI3K and MAPK signaling pathway inhibits the transcription activity by adjusting the FOXO1 phosphorylation levels，F(xiàn)OXO1 inhibits GIST-T1 cell proliferation through down regulate the expression of Bcl2，up regulation of Bax and two kinds of inhibitors have synergistic effect.

FOXO1；PI3K；MAPK；gastrointestinal stromal tumor；Bcl2；Bax

R735.2

A

1005－1678（2014）09－0020－04

中國(guó)醫(yī)學(xué)基金會(huì)資助項(xiàng)目（314.2212）

高華，男，碩士，研究方向：胃腸道腫瘤基礎(chǔ)與臨床，E-mail：gaohuadoctor＠163.com；通信作者，閆峰，男，醫(yī)學(xué)博士、博士后，副教授、副主任醫(yī)師、碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：yanfeng＠xmzsh.com。