顧夙，徐守宇

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院骨科，河南南陽473000；2.浙江中醫(yī)藥學院附屬第三臨床醫(yī)學院骨科，浙江杭州310053）

白花蛇舌草對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠的保護作用

顧夙1，徐守宇2

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院骨科，河南南陽473000；2.浙江中醫(yī)藥學院附屬第三臨床醫(yī)學院骨科，浙江杭州310053）

目的探討白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.，HD）對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠（collagen-induced arthritis，CIA）的保護作用。方法60只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組（n＝10）和給藥組（n＝50），給藥組用于建立Wistar大鼠CIA模型，造模成功后再隨機分為模型組，雷公藤組，白花蛇舌草低、中、高劑量組，每組各9只并給予相應藥物處理。自造模后第14天開始，每周觀察各給藥組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，于第42天處死大鼠檢測各組血清的IL-1β、TNF-α水平，對比各組大鼠滑膜組織膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達情況。結(jié)果HD低劑量組在第35天及42天時，關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著低于模型組（P＜0.05）；HD高劑量組在第28、35及42天時，關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05）；HD各劑量組、IL-1β、TNF-α水平均顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；HD各劑量組膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達量顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論HD可降低細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平，緩解膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應及骨質(zhì)侵蝕，提示HD對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)具有保護作用。

白花蛇舌草；膠原誘導性關(guān)節(jié)炎；大鼠；保護作用

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性、全身性自身免疫疾?。?］，研究認為其發(fā)病機制與遺傳因素、感染因素、免疫因素、內(nèi)分泌因素等相關(guān)［2-3］。目前，RA尚無根治的方法，傳統(tǒng)西醫(yī)治療RA藥物有4大類：非甾體抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）、改善病情抗風濕藥（disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）、糖皮質(zhì)激素和生物制劑（如TNF-α抑制劑等）［4-5］。上述藥物主要改善癥狀、緩解病情，因不能根治疾病，并且有嚴重的胃腸道、肝腎功能損害等不良反應，難以推廣使用。我國民間應用中藥組方（如益氣解毒化瘀湯、痹腫消湯等）對RA的治療已有悠久的歷史。現(xiàn)代實驗研究表明組方中單味中藥白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld.，HD）具有與治療RA相關(guān)的抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等作用［6］。為進一步探討清熱解毒藥物白花蛇舌草對RA的治療機理，本研究采用膠原誘導制作關(guān)節(jié)炎性Wistar大鼠模型（collagen-induced arthritis，CIA），觀察HD抗風濕的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：雄性SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量為（200±10）g，8周齡，購自內(nèi)蒙古大學動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK（蒙）2012-0001。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 實驗試劑：完全弗氏佐劑（美國SIGMA公司，批號070M8704）；不完全弗氏佐劑（美國SIGMA公司，批號050M873）；牛II型膠原（美國Chondrex公司，批號110374、120197）；白花蛇舌草片（天津市中藥飲片廠，國藥準字Z36020632）；雷公藤多甙片（黃石飛云制藥有限公司，國藥準字Z42021212）；大鼠TNF-αELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號G26030370）；大鼠IL-1βELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號G12030371）；β-actin（TA-09，北京中杉金橋公司）；全蛋白提取試劑盒（BSP003，上海生工生物工程有限責任公司）；Rabbit Anti-AnnexinⅠ（Abcam）；IRDye 800cw Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）（美國LICOR公司）。

1.1.3 實驗儀器：Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國LICOR公司）；TE77XP半干電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（賽默飛世爾上海儀器有限公司）；1730R高速低溫離心機（基因有限公司）；Multiskan Mk3酶標儀（PE公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組：60只雄性Wistar大鼠，購回適應性喂養(yǎng)2周后，按隨機數(shù)字表法從60只大鼠中分出10只作為正常組，余下50只為給藥組，用于進行CIA模型的復制。

1.2.2 CIA大鼠模型的建立：按Chondrex公司膠原誘導性（CIA）大鼠模型制備的說明書進行，具體方法：先將牛Ⅱ型膠原10 mg完全溶合于0.05 mol／L乙酸水5mL中，配制成2mg／mL的牛Ⅱ型膠原溶液，再將5 mL此溶液與5 mL完全弗氏佐劑（Freund's complete adjuvant，F(xiàn)CA）充分混勻，配制成1mg／mL的牛Ⅱ型膠原溶液，模型組每只大鼠尾根部皮下注射抗原0.2mL；于7 d后用5mL牛Ⅱ型膠原與5mL不完全弗氏佐劑（Freund's incomplete adjuvant，IFA）用同樣方法配制成1 mg／mL牛Ⅱ型膠原溶液，以每只0.1mL于大鼠尾根部皮下注射再次免疫。正常組注射同樣劑量的生理鹽水。在初次免疫2周后，對動物模型進行全面評估，剔除模型復制不成功動物。成功復制的CIA模型大鼠45只，造模成功率為90%。把造模成功的大鼠隨機分為模型組、雷公藤組、HD低劑量組、HD中劑量組及HD高劑量組，每組各9只。

1.2.3 白花蛇舌草劑量的確定：根據(jù)體表面積折算的等效劑量比值（詳見《藥理實驗方法學》）［7］，70 kg成人，每天服用白花蛇舌草30 g，相當于大鼠灌胃6 g／（kg·d），再取該劑量的相差1倍的相鄰劑量，即確定3個干預劑量3 g／（kg·d）、6 g／（kg·d）、12 g／（kg·d）。

1.2.4 給藥方法：于注射免疫14 d后，正常組及模型組給予蒸餾水灌胃1mL／（只·天），雷公藤組給予6.3 mg／（kg·d）雷公藤，HD低、中、高3個治療組灌服白花蛇舌草片，灌胃劑量分別：3 g／（kg·d）、6 g／（kg·d）、12 g／（kg·d），1次／天，時間固定在上午9∶00，連續(xù)灌胃42 d。

1.2.5 觀察指標

①一般情況觀察：精神狀態(tài)、被毛、食欲和活動情況，大鼠體質(zhì)量增長變化。

②關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）測定：自造模后第14天開始給大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病情況計分。該積分法主要內(nèi)容為5級積分。其中，無關(guān)節(jié)炎現(xiàn)象記0分；小拇趾關(guān)節(jié)部位出現(xiàn)紅熱腫痛現(xiàn)象記1分；趾關(guān)節(jié)和足跖部出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象記2分；踝關(guān)節(jié)以下部位出現(xiàn)紅腫脹痛記3分；踝關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)以下部位出現(xiàn)紅腫脹痛者4分。最后積分為四肢關(guān)節(jié)評分總分之和［8］。

③血清IL-1β及TNF-α水平測定：實驗至42d時，各組大鼠禁食12h后斷頭取血，離心取上清液，按ELISA試劑盒說明書步驟，檢測各組血清中IL-1β及TNF-α水平。

④ 膜聯(lián)蛋白Ⅰ表達檢測：取已處死大鼠的滑膜組織，Westernblot法檢測膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達情況。方法如下：抽提滑膜蛋白，測濃度，每孔上樣量50μg，10%SDS-PAGE電泳，電壓100 V；轉(zhuǎn)膜，電流18mA，時間40min；一抗?jié)舛?∶500，4℃搖床孵育過夜；二抗?jié)舛?∶5000，室溫避光搖床孵育1 h；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（Odyssey）成像，運用儀器自帶軟件對結(jié)果進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。正態(tài)計量資料以“±s”表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各給藥組大鼠AI變化情況 HD低劑量組在第35天及42天時，關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著低于模型組（P＜0.05）；HD高劑量組在第28、35及42天時，關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05，見表1）。

表1 各給藥組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）比較（分）Tab.1 Comparison of the arthritic index in each drug groups（score）

2.2 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比較 42 d時，模型組、HD各劑量組IL-1β、TNF-α水平顯著高于正常組（P＜0.05）；高、中、低劑量組IL-1β、TNF-α水平顯著低于模型組（P＜0.05）；其中高劑量組的降低程度顯著優(yōu)于中、低劑量組（P＜0.05，見表2）。

表2 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比較（pg／mL）Tab.2 Comparison of the levels of IL-1βand TNF-αin each groups（pg／mL）

2.3 各組大鼠滑膜組織膜聯(lián)蛋白Ⅰ的灰度值比較 42 d時，HD各劑量組膜聯(lián)蛋白Ⅰ的灰度值顯著低于模型組 （P＜0.05，見表3）。

表3 各組大鼠滑膜組織膜聯(lián)蛋白Ⅰ的灰度值比較Tab.3 Comparison of the gray value of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in each groups

3 討論

白花蛇舌草為痹腫消湯中的君藥之一，是臨床上常用清熱解毒藥。其藥理活性、化學成分及質(zhì)量控制等方面的研究已有文獻基礎(chǔ)［9］：白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、保肝利膽等生物活性；化合物組成包括黃酮類、葸醌類、萜類、甾醇類、多糖類和酚酸類等。

目前，已有白花蛇舌草治療RA相關(guān)機制的研究，主要通過調(diào)節(jié)免疫，下調(diào)炎癥因子水平，抑制血管新生等方面起作用。張良等［10］研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草對RA患者體外滑膜細胞的增殖有抑制作用。王瑞等［6］研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草能通過抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）緩解膠原誘導性（CIA）大鼠癥狀、控制炎癥。顧士棟等［11］研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草能夠清除氧化損傷后細胞內(nèi)過多的活性氧（ROS），而減輕荷瘤小鼠正常器官氧化損傷。

本研究根據(jù)Trentham等［15］提出的Ⅱ型膠原可產(chǎn)生抗原效應而造成組織免疫性損傷理論，應用Ⅱ型膠原建立大鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型。該模型特征與人類RA非常相似，是目前國內(nèi)外研究類風濕性關(guān)節(jié)炎最優(yōu)選的動物模型。研究結(jié)果顯示，CIA大鼠經(jīng)HD治療28d后飲食、活動有所增強，毛發(fā)較模型組有光澤，關(guān)節(jié)炎指數(shù)與模型組比較有明顯差異；血清中IL-1β、TNF-α含量，較模型組明顯下降，且具有一定的劑量依賴性，說明HD可減輕CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，降低炎性細胞因子IL-1β、TNF-α的水平?？赡茉蛟谟诎谆ㄉ呱嗖萃ㄟ^下調(diào)IL-1β、TNF-α水平，抑制黏附分子、血管內(nèi)皮生長因子及其他炎癥因子的產(chǎn)生，促進骨膠原合成，減少金屬蛋白酶的表達及活性，而起到減輕關(guān)節(jié)炎癥反應、骨質(zhì)侵蝕和減少血管翳形成的作用［12-16］。這與王瑞等［6］研究結(jié)果相一致。同時研究發(fā)現(xiàn)，HD各劑量組膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達水平明顯高于正常組與模型組，說明白花蛇舌草可明顯上調(diào)膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達?？赡茉蛟谟谀ぢ?lián)蛋白Ⅰ作為抗炎反應的調(diào)控因子，在HD的作用下，其生成量增多，直接占據(jù)嗜中性粒細胞表面受體或抑制單核細胞、巨噬細胞分泌白細胞介素和血漿腫瘤壞死因子，進而抑制炎癥細胞黏附、滲出及浸潤［17-19］。

綜上所述，HD可降低細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平，緩解膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應，提示HD對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)具有保護作用。但是由于中藥化學成分的復雜性使得中藥難以向世界推廣，得到國際認可，因此未來提取HD中單一有效成分進行研究是必要的。同時這些提取的化學成分，是否為HD口服后在體內(nèi)可吸收成分，是否為HD治療RA療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，需要利用生物藥理分析方法進行實驗研究來探究。

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（編校：王冬梅，吳茜）

Protective effect of Hedyotis diffusa Willd.on collagen-induced arthritismodel rat

GU Su1，XU Shou-yu2

（1.Department of Orthopaedic，Nanyang Municipal Central Hospital，Nanyang 473000，China；2.Department of Orthopaedic，The Third Affiliated Clinical Medical School of Zhejiang Traditional Chinese Medicine College，Hangzhou 310053，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of Hedyotis diffusa Willd.on collagen-induced arthritis ratmodel.Methods60 maleWistar ratswere randomly divided into normal controlgroup（n＝10）and drug group（n＝50），the drug group were used to induced CIAmodel ofWistar rats，then were random ly divided into CIAmodel group，tripterygium group，low-dose HD group，medium-dose HD group，high-dose HD group，with 9 rats in each group，and were treated with homologous drugs.Since the14th day after induced，the arthritic index of all rats atdifferent time pointswere observed and measured.At42th day，all ratswere killed tomeasure the changes of serum cytokine levels including IL-1β，TNF-αlevel，and the gray value of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in each group were compared.ResultsThe arthritic index，in HD low dose group at 35thand 42th day were significantly lower than that inmodel group，and in HD high dose group at28th，35thand 42th day were significantly lower than those in model group，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.The levels of IL-1βand TNF-αin all HD dose groups were significantly lower than that in model group，and the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.The expression of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in all HD dose groups were significantly higher than that inmodel group，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.ConclusionHD could reduce the levels of cytokines（IL-1β，TNF-α），and alleviate the inflammatory response and bone erosion in CIA model.It is suggested that Hedyotis diffusa Willd.has the protective effect on collagen-induced arthritis rat.

Hedyotis diffusa Willd；collagen-induced arthritis；rat；protective effect

R32

A

1005－1678（2014）09－0064－04

2011年浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計劃（2011KYA116）

顧夙，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：骨關(guān)節(jié)，E-mail：qch1821460065＠163.com。