吳 婷， 林珊珊

肥胖及高血脂與急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)關(guān)系密切，不僅誘發(fā)AP，而且加重胰腺組織的病理?yè)p害，但是其加重?fù)p害的機(jī)制至今未完全闡明。研究已表明，AP時(shí)抵抗素合成分泌增加[1]，抵抗素具有促進(jìn)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生及微循環(huán)障礙的作用，從而加重AP的病情。伴高脂血癥性AP(hyperlipidemic acute pancreatitis, HAP)時(shí)抵抗素水平的變化國(guó)內(nèi)外研究較少，本研究擬通過(guò)飲食方式誘導(dǎo)建立高脂血癥大鼠模型，研究伴與不伴高脂血癥的急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠血清及胰腺組織抵抗素表達(dá)的變化，以及其與炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之間的關(guān)系，以期進(jìn)一步了解抵抗素在伴高脂血癥的ANP發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立與分組 健康雄性SD大鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SOXK(閩)2012-0001]50只，體質(zhì)量170～180 g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)5只、單純ANP組(ANP組)15只、高脂對(duì)照組(H組)15只、高脂ANP組(HAP組)15只。分別用基礎(chǔ)飼料(C、ANP組)及高脂飼料(H、HAP組)喂養(yǎng)4周；高脂飼料配方[2](主要成分為87.8%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.2%膽酸鈉等，購(gòu)自閩侯縣吳氏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。ANP及HAP組采用傳統(tǒng)的手術(shù)方法制備ANP模型(3.5%?；悄懰徕c1 mL/kg體質(zhì)量，以0.2 mL/min的速度逆行胰膽管注射)；C、H組采用逆行胰膽管注射生理鹽水，劑量和速度同上。造模成功后4，9，24 h各處死5只大鼠，抽血測(cè)定血清淀粉酶、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平，取胰頭組織行H-E染色，胰腺組織病理半定量積分參照Kusske法[3](對(duì)胰腺組織在光鏡下的表現(xiàn)按水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死3方面的輕重程度評(píng)分，共分3級(jí)，無(wú)病理改變者0分，最重者9分)。

1.2血清TNF-ɑ和抵抗素水平的測(cè)定 腹腔動(dòng)脈采血5～6 mL，靜置1 h后3 000 r/min離心10 min分離血清，置于-20 ℃冰箱，待標(biāo)本收集后吸取各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清上清液50 μL，采用ELISA法測(cè)定血清TNF-ɑ和抵抗素濃度，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3胰腺組織抵抗素及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65表達(dá)水平的測(cè)定

1.3.1石蠟切片制備 分別于造模后4，9，24 h各處死5只大鼠，剖腹后取胰腺組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片5 μm并附于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸附膜的載玻片上，保存于4 ℃冰箱中。

1.3.2超敏二步免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰腺組織抵抗素及NF-κB p65表達(dá)水平 石蠟切片置于37 ℃恒溫箱中烤片過(guò)夜，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉等處理后，滴加一抗(1∶100兔抗大鼠NF-κB p65抗體及1∶25羊抗大鼠抵抗素抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司)后置于濕盒中，37 ℃恒溫箱中孵育2 h，滴加試劑1(Polymer Helper)室溫孵育20 min，滴加試劑2(poly-HRP anti-Rabbit IgG)室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，脫水透明，封片鏡檢。陽(yáng)性對(duì)照由購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)抗體的試劑公司提供，PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.3.3使用專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus計(jì)算各組胰腺組織抵抗素及NF-κB p65表達(dá)的平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1模型鑒定 全部大鼠飼養(yǎng)4周后手術(shù)，直至模型制備完畢后24 h，各組大鼠無(wú)一死亡，其中C、H組大鼠狀態(tài)較好，大多數(shù)可活動(dòng)或飲水，ANP、HAP組大鼠大多精神萎靡、懶動(dòng)，基本無(wú)活動(dòng)或飲水。造模成功率100%。

ANP組血清淀粉酶水平較C、H組明顯升高，高脂飼料組血清TC、TG水平高于正常飼料組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。光鏡下觀(guān)察，ANP、HAP組胰腺組織明顯水腫，尤其是HAP組，造模后9，24 h在壞死、出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分等方面較ANP組顯著加重，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組血清淀粉酶、血脂水平及胰腺組織病理學(xué)評(píng)分

2.2大鼠血清TNF-ɑ水平測(cè)定結(jié)果 與C組比較，ANP組和HAP組大鼠術(shù)后4 h血清TNF-ɑ水平已明顯升高，24 h時(shí)達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-ɑ濃度明顯高于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ANP組比較，HAP組大鼠術(shù)后4和9 h TNF-ɑ水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，但24 h明顯升高(P<0.05)，具體見(jiàn)表2。

表2 血清TNF-ɑ水平

2.3大鼠血清抵抗素水平測(cè)定結(jié)果 與C組比較，ANP組大鼠術(shù)后4 h血清抵抗素水平開(kāi)始升高，24 h時(shí)達(dá)到高峰，明顯高于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與H組比較，HAP組大鼠術(shù)后4 h血清抵抗素濃度開(kāi)始升高，24 h時(shí)濃度明顯高于H組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ANP組比較，HAP組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)抵抗素水平均明顯高于ANP組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 血清抵抗素水平

2.4血清抵抗素水平與TNF-ɑ水平、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分相關(guān)分析 血清TNF-ɑ和抵抗素水平均在造模后迅速上升，至24 h達(dá)高峰，HAP組和ANP組的血清抵抗素水平和TNF-ɑ水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.365和r=0.698，P<0.05)，ANP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與血清抵抗素、TNF-ɑ水平均呈正相關(guān)(r=0.657和r=0.732，P<0.05)，HAP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與血清抵抗素、TNF-ɑ水平均呈正相關(guān)(r=0.632和r=0.661，P<0.05)。

2.5大鼠胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平 造模后早期胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平即升高，與C組和H組比較，ANP組和HAP組4 h胰腺組織NF-κB p65表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，主要表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞和間質(zhì)炎癥細(xì)胞，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，NF-κB p65表達(dá)逐漸增加，24 h達(dá)高峰(圖1)。HAP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平均較ANP組增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見(jiàn)表4。

表4 胰腺組織NF-κB p65平均光密度值

A：C組，B：H4h組，C：H9h組，D：H24h組，E：ANP4h組，F(xiàn)：ANP9h組，G：ANP24h組，H：HAP4h組，I：HAP9h組，J：HAP24h組. C組及H組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織均未見(jiàn)明顯NF-κB p65表達(dá)，ANP組及HAP組各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)NF-κB p65表達(dá)，主要表達(dá)于腺細(xì)胞胞質(zhì)及小葉間質(zhì)中. NF-κB p65表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加；與ANP組比較，HAP組各時(shí)間點(diǎn)有更明顯的NF-κB p65表達(dá).

2.6大鼠胰腺組織抵抗素表達(dá)水平 與C組比較，H24h組胰腺組織抵抗素表達(dá)水平有所增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與C組和H組比較，ANP4h和HAP4h胰腺組織抵抗素表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2，表5。

2.7胰腺組織抵抗素表達(dá)水平與胰腺組織NF-κBp65表達(dá)水平、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分相關(guān)分析 胰腺組織抵抗素和NF-κB p65表達(dá)水平在造模后迅速上升，至24 h達(dá)高峰，HAP組和ANP組的胰腺組織抵抗素表達(dá)水平和NF-κB p65表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.839和r=0.957，P<0.01)，ANP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與胰腺組織抵抗素及NF-κB p65表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.946和r=0.944，P<0.01)，HAP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與胰腺組織抵抗素及NF-κB p65表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.904和r=0.857，P<0.01)。

A：C組，B：H4h組，C：H9h組，D：H24h組，E：ANP4h組，F(xiàn)：ANP9h組，G：ANP24h組，H：HAP4h組，I：HAP9h組，J：HAP24h組. C組及H組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織均未見(jiàn)明顯抵抗素表達(dá)，ANP組及HAP組各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)抵抗素的表達(dá)，主要表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞和胰腺壞死區(qū)域中；抵抗素表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加.

表5 胰腺組織抵抗素平均光密度值

3 討 論

SAP是全身炎癥反應(yīng)性疾病，其病理過(guò)程是胰腺腺泡內(nèi)胰酶的異常激活，活化的胰酶對(duì)胰腺組織自身進(jìn)行消化，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞的激活、炎癥介質(zhì)的釋放，最后通過(guò)炎癥介質(zhì)的相互作用促進(jìn)炎癥的擴(kuò)大[4]。細(xì)胞因子屬于炎癥介質(zhì)的范疇，目前認(rèn)為與AP關(guān)系較為密切的細(xì)胞因子有TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8等，這些炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)在基因水平上受到轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)控。NF-κB信號(hào)通路參與了AP的發(fā)病及病情發(fā)展，多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn),AP早期即有NF-κB的活化，胰腺組織NF-κB表達(dá)增加，藥理學(xué)抑制NF-κB能夠改善胰腺炎的病情,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)胰腺p65和IKK2表達(dá)能夠引起胰腺炎[5-8]。Huang等通過(guò)轉(zhuǎn)基因途徑構(gòu)建胰腺組織編碼p65的小鼠動(dòng)物模型，通過(guò)與正常小鼠的比較發(fā)現(xiàn)：p65轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)哇皮素誘導(dǎo)胰腺炎模型后有更高的炎癥因子水平，胰腺組織病理?yè)p害更重。持續(xù)3月的胰腺組織NF-κB活化導(dǎo)致了胰腺組織類(lèi)似慢性胰腺炎的病理改變[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，AP造模后4 h胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平即升高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，NF-κB p65表達(dá)逐漸增加，24 h達(dá)高峰，胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平均呈正相關(guān)。與ANP組比較，HAP組胰腺組織病理?yè)p害更重，同時(shí)胰腺組織NF-κB p65表達(dá)水平更高。

脂肪細(xì)胞因子抵抗素作為上游炎癥介質(zhì)，具有調(diào)節(jié)新陳代謝和免疫反應(yīng)的作用，它不僅能夠募集炎癥細(xì)胞，刺激TNF-α、IL-2、IL-6等促炎細(xì)胞因子的釋放，還可以促進(jìn)微循環(huán)障礙的形成[10-11]，從而加重AP的病情。AP患者及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都觀(guān)察到升高的抵抗素水平，抵抗素升高的水平與病情的嚴(yán)重程度及血清CRP水平呈正相關(guān)，能夠作為胰周脂肪壞死的標(biāo)志，可以預(yù)測(cè)胰周脂肪壞死的范圍及病情的嚴(yán)重程度[1]，這些均提示AP時(shí)胰周脂肪組織壞死釋放的抵抗素可能通過(guò)促炎癥作用而加重病情。目前關(guān)于抵抗素與AP的研究多為臨床研究，國(guó)內(nèi)徐克群等通過(guò)L-精氨酸腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)大鼠ANP模型，發(fā)現(xiàn)ANP模型大鼠血清和胰腺組織的抵抗素表達(dá)水平明顯升高，與血清TNF-α、IL-1β、CRP水平和胰腺組織病理評(píng)分呈正相關(guān)，注射重組抵抗素后，血清TNF-α、IL-1β水平升高[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組相比，ANP組和HAP組造模術(shù)后4 h血清及胰腺組織抵抗素表達(dá)開(kāi)始升高，24 h達(dá)高峰，血清抵抗素水平與TNF-α水平呈正相關(guān)，胰腺組織抵抗素表達(dá)與NF-κB p65表達(dá)、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)，也支持抵抗素可能通過(guò)NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)TNF-α的釋放參與ANP病情的發(fā)生發(fā)展。

隨著膳食結(jié)構(gòu)的改變，高脂血癥及肥胖人群增加，高脂血癥肥胖與胰腺炎之間的因果關(guān)系存在爭(zhēng)議。本課題組前期研究證實(shí)了高脂血癥不僅誘發(fā)AP，而且能加重AP時(shí)胰腺組織的病理?yè)p害[13-14]。楊體雄等的研究發(fā)現(xiàn)，在相同致病因素前提下，高TG血癥是導(dǎo)致胰腺炎進(jìn)一步發(fā)展的促進(jìn)因素[15]。同時(shí)臨床研究發(fā)現(xiàn)，肥胖是胰腺炎發(fā)生發(fā)展的一個(gè)危險(xiǎn)因素，與非肥胖患者相比，肥胖患者胰腺炎的發(fā)生率更高，尤其腹型肥胖與AP病情的嚴(yán)重性相關(guān)[16-18]，這些觀(guān)察提示腹腔內(nèi)脂肪組織可能在AP發(fā)病中起重要的病理生理作用。國(guó)內(nèi)外一些研究[1,12]及本研究均證實(shí)，AP時(shí)胰腺組織及胰周脂肪細(xì)胞壞死可能引起抵抗素的釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而高脂肥胖雙重致病因素作用下的胰腺炎抵抗素的表達(dá)怎樣尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂喂養(yǎng)4周,經(jīng)淀粉酶、血脂、病理評(píng)分等評(píng)估，說(shuō)明高脂飼料喂養(yǎng)4周能夠成功建立伴高脂血癥性ANP大鼠模型，高脂血癥能加重急性胰腺炎時(shí)胰腺組織的病理?yè)p害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組和H組比較，ANP和HAP組各時(shí)間點(diǎn)血清及胰腺組織抵抗素表達(dá)水平均明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抵抗素參與了重癥AP的發(fā)病。與ANP組各時(shí)間點(diǎn)比較，HAP組血清及胰腺組織抵抗素表達(dá)水平更高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且與TNF-α、與NF-κB p65表達(dá)、胰腺組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同致病因素前提下，高脂肥胖可能通過(guò)增加血清及胰腺組織抵抗素的表達(dá)激發(fā)炎癥細(xì)胞因子的釋放從而導(dǎo)致胰腺組織病理?yè)p害較重。當(dāng)然，脂肪細(xì)胞因子除抵抗素外還有脂聯(lián)素、內(nèi)脂素等，關(guān)于其他脂肪細(xì)胞因子在AP發(fā)病中扮演怎樣角色，還有待深入研究。

總之，通過(guò)本研究，筆者認(rèn)為抵抗素參與了重癥AP的發(fā)病過(guò)程，可能通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的表達(dá)及TNF-α的釋放發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在伴高脂血癥性重癥AP中，抵抗素的過(guò)表達(dá)可能是加重病情的原因之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] Schaffler A, Hamer O, Dickopf J,etal. Admission resistin levels predict peripancreatic necrosis and clinical severity in acute pancreatitis[J].AmJGastroenterol, 2010,105(11):2474-2484.

[2] 吳 婷, 王昭智. 一氧化氮在伴高脂血癥急性出血壞死性胰腺炎大鼠胰腺及腎損害中的作用[J]. 世界華人消化雜志, 2011,19(10):1022-1027.

[3] Xu P, Zhou X J, Chen L Q,etal. Pioglitazone attenuates the severity of sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis[J].WorldJGastroenterol, 2007,13(13):1983-1988.

[4] Bhatia M, Wong F L, Cao Y,etal. Pathophysiology of acute pancreatitis[J].Pancreatology, 2005,5(2-3):132-144.

[5] Sah R P, Garg P, Saluja A K. Pathogenic mechanisms of acute pancreatitis[J].CurrOpinGastroenterol, 2012,28(5):507-515.

[6] Satoh A, Shimosegawa T, Fujita M,etal. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation improves the survival of rats with taurocholate pancreatitis[J].Gut, 1999,44(2):253-258.

[7] Chen X, Ji B, Han B,etal. NF-kappaB activation in pancreas induces pancreatic and systemic inflammatory response[J].Gastroenterology, 2002,122(2):448-457.

[8] Algul H, Treiber M, Lesina M,etal. Pancreas-specific RelA/p65 truncation increases susceptibility of acini to inflammation-associated cell death following cerulein pancreatitis[J].JClinInvest, 2007,117(6):1490-1501.

[9] Huang H, Liu Y, Daniluk J,etal. Activation of nuclear factor-kappaB in acinar cells increases the severity of pancreatitis in mice[J].Gastroenterology, 2013,144(1):202-210.

[10] Pirvulescu M, Manduteanu I, Gan A M,etal. A novel pro-inflammatory mechanism of action of resistin in human endothelial cells: up-regulation of SOCS3 expression through STAT3 activation[J].BiochemBiophysResCommun, 2012,422(2):321-326.

[11] Falcao-Pires I, Castro-Chaves P, Miranda-Silva D,etal. Physiological, pathological and potential therapeutic roles of adipokines[J].DrugDiscovToday, 2012,17(15-16):880-889.

[12] 徐克群, 薛樂(lè)寧, 龔燕芳, 等. 羅格列酮在急性壞死性胰腺炎中對(duì)抵抗素的影響[J]. 中華消化雜志, 2010,30(7):493-495.

[13] Ponzo O, Schreier L, Resnik R,etal. Endogenous hypertriglyceridemia intensifies the course of cerulein-induced pancreatitis in rat: relation with changes in the VLDL composition[J].AnnNutrMetab, 2006,50(1):37-44.

[14] Zhang W, Zhao Y, Zeng Y, etal. Hyperlipidemic versus normal-lipid acute necrotic pancreatitis: proteomic analysis using an animal model[J].Pancreas, 2012,41(2):317-322.

[15] 楊體雄, 周亞魁, 何躍明, 等. 高甘油三脂血癥對(duì)急性胰腺炎的發(fā)生及其病理?yè)p害程度的影響[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2001,18(6):544-545.

[16] Chen S M, Xiong G S, Wu S M. Is obesity an indicator of complications and mortality in acute pancreatitis An updated meta-analysis[J].JDigDis, 2012,13(5):244-251.

[17] Hong S, Qiwen B, Ying J,etal. Body mass index and the risk and prognosis of acute pancreatitis: a meta-analysis[J].EurJGastroenterolHepatol, 2011,23(12):1136-1143.

[18] Sadr-Azodi O, Orsini N, Andren-Sandberg A,etal. Abdominal and total adiposity and the risk of acute pancreatitis: a population-based prospective cohort study[J].AmJGastroenterol, 2013,108(1):133-139.