劉崇武， 吳春芳， 駱 凱， 李艷芬， 閆福華

牙周病是最常見的口腔疾病之一，菌斑微生物是造成牙周組織病理變化的始動(dòng)因子，且其本身及其釋放的代謝產(chǎn)物如內(nèi)毒素等又可以通過多種途徑播散到宿主全身其他器官，作為一些疾病的獨(dú)立或高危因子而受到多學(xué)科的廣泛關(guān)注。近年來學(xué)者們陸續(xù)在冠心病患者的心血管壁上找到了與牙周致病菌相關(guān)的DNA蹤跡及一些主要致病物質(zhì)，如慢性牙周炎的主要致病菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)可以沉積于動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)粥樣斑塊中，促進(jìn)低密度脂蛋白的氧化和聚集，加快泡沫細(xì)胞形成[1-3]。2005年，Brodala等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Pg引起的菌血癥可以誘導(dǎo)正常和高膽固醇水平豬冠狀動(dòng)脈血栓和AS的形成[4]。

肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages,AM)是AS發(fā)生、發(fā)展過程中機(jī)體行使免疫防御和炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，幾乎參與粥樣斑塊形成的整個(gè)病理過程[5-6]。AM表面的清道夫受體-A(SR-A)是結(jié)合和降解AS形成過程中氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein cholesterol,oxLDL)的重要受體，與脂質(zhì)代謝、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的清除等密切相關(guān)[7]。白細(xì)胞介素-10(interleukins-10,IL-10)是近年來研究最為廣泛的一種抗炎因子，具有抑制粥樣斑塊形成、穩(wěn)定斑塊的作用[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)通過比較健康和高脂血癥兔肺來源AM在牙齦Pg-LPS作用下膜表面SR-A的表達(dá)變化以及IL-10對(duì)其的調(diào)控作用，以期為研究牙周病與AM的相關(guān)性提供細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 健康成年新西蘭兔12只[中科院上海研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0007]，2.0～2.5 kg，3～4月齡，雌雄不限，喂養(yǎng)于中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科。

1.2試劑與儀器 RPMI 1640粉(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，肝素鈉(上海信宜制藥)，IL-10(英國Pepro Tech公司)，Pg-LPS及Real-time PCR反應(yīng)體系中各試劑(美國Invitrogen公司)。CO2培養(yǎng)箱(BB16)及臺(tái)式離心機(jī)(Labofuge 400R)(德國Heraeus公司)，QPCR儀(7500 fast,美國Applied Biosystems公司)。

1.3方法

1.3.1高脂血癥新西蘭兔模型的建立 新西蘭兔12只單個(gè)分籠飼養(yǎng)于25 ℃、70%濕度的環(huán)境中，保持室內(nèi)自動(dòng)通風(fēng)，適應(yīng)1周后隨機(jī)編號(hào)分為對(duì)照組和高脂模型組，分別予基礎(chǔ)飼料和高脂飼料喂養(yǎng)。參照文獻(xiàn)[10]，飼料配方為基礎(chǔ)飼料+1%膽固醇+5%豬油+15%鮮蛋黃，每只100～120 g/d，自由飲水，喂飼6周后空腹抽取兔耳緣靜脈血，檢測(cè)血脂各項(xiàng)指標(biāo)，包括血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，證實(shí)高脂血癥新西蘭兔模型已成功建立。

1.3.2細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將2組實(shí)驗(yàn)兔通過耳緣靜脈注射空氣處死，提起氣管無菌分離出肺，生理鹽水沖洗表面去除血污，無菌紗布吸去多余水分后，注射器沿氣管緩慢注入4 ℃預(yù)冷的灌洗液40 mL(生理鹽水+10 U/mL肝素鈉)，輕柔晃動(dòng)兔肺5 min，回收灌洗液于50 mL離心管，并重復(fù)灌洗1次，2次所得細(xì)胞灌洗液4 ℃離心，沉淀用RPMI 1640洗滌離心2次，1 500 r/min，10 min。收集的細(xì)胞沉淀用RPMI 1640+20% FBS培養(yǎng)液重懸，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h，AM貼壁后，換RPMI 1640+10% FBS培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.3分組與細(xì)胞準(zhǔn)備 將所得的6只健康和6只高脂兔AM分別消化并接種于六孔板，每孔1×106，對(duì)照組、1 μg/mL Pg-LPS組、1 μg/mL Pg-LPS+0.1 μg/mL IL-10組均重復(fù)3孔，培養(yǎng)24 h，換RPMI 1640+1% FBS培養(yǎng)液使其饑餓同步化2 h。隨后參照文獻(xiàn)[11-13]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，先加入IL-10，使其終濃度為0.1 μg/mL，2 h后于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組加入Pg-LPS，終濃度為1 μg/mL，作用24 h后按照試劑盒說明使用TRIZOL試劑裂解細(xì)胞，用1.5 mL無菌Eppendorf管分裝，冷凍保存于-70 ℃冰箱備用。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR) 按照試劑盒說明書操作進(jìn)行RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA，隨后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列：

目的基因：

SR-A-F：5′-GGTCCTCCTGGACCCCCAGGA-3′

SR-A-R：5′-CAGGATGCTTCCACTGCCT-3′

管家基因：

rabbit-actin(737 bp)：5′-TGGACTTCGAGCAGGAGA

TG-3′

rabbit-actin(943 bp)：5′-GGATGTCCACGTCGCACT

T-3′

片段大小206 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s→70 ℃ 45 s)，70 ℃延伸10 min。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 分別對(duì)各樣品目的基因和管家基因進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。機(jī)器根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接生成各樣品目的基因和管家基因的濃度。計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量：

F=2—△△Ct

△△Ct=(待測(cè)樣品目的基因的Ct平均值-待測(cè)樣本看家基因的Ct平均值)-(對(duì)照樣品目的基因的Ct平均值-對(duì)照樣本看家基因的Ct平均值)

2 結(jié) 果

2.1培養(yǎng)的AM細(xì)胞 倒置相差顯微鏡下觀察，AM呈圓形或卵圓形，不易增殖，體外可培養(yǎng)7～10 d，貼壁不牢固，換液可使部分細(xì)胞浮起。健康兔AM周邊或兩極可見細(xì)小偽足(圖1A)。而高脂血癥兔AM部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，偽足更為細(xì)長，呈成纖維樣生長(圖1B)。

A：健康兔肺泡巨噬細(xì)胞周邊或兩極可見細(xì)小偽足；B：高脂兔肺巨噬細(xì)胞部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，偽足更為細(xì)長，呈成纖維樣生長.

2.2SR-A的基因表達(dá) 根據(jù)Real-time PCR結(jié)果，分別計(jì)算健康和高脂兔各實(shí)驗(yàn)組SR-A基因的相對(duì)表達(dá)量(表1)。統(tǒng)計(jì)分析表明，各高脂組SR-A基因的表達(dá)量均高于健康組(P<0.05)；健康及高脂血癥Pg-LPS組SR-A的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，且高脂Pg-LPS組較健康Pg-LPS組升高更為顯著；在增加IL-10后，健康組SR-A的表達(dá)高于單純Pg-LPS組(P<0.05)，高脂組SR-A的表達(dá)則低于單純Pg-LPS組(P<0.05)。

表1 SR-A基因表達(dá)水平

3 討 論

牙周病和AS心血管疾病都是與機(jī)體免疫調(diào)控功能失衡有關(guān)的慢性炎癥性疾病[14-15]，在人群中分布廣泛。感染和炎癥是兩者共同的危險(xiǎn)因素，已有的研究表明牙周感染可使機(jī)體的脂代謝紊亂，導(dǎo)致血脂水平升高，進(jìn)而增加冠心病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[16]。

學(xué)者們普遍認(rèn)可AS是脂質(zhì)和炎癥共同作用的結(jié)果[17]。AS病損早期，血液中膽固醇增高、脂質(zhì)代謝紊亂，LDL大量被氧化修飾成oxLDL，oxLDL逐漸向受損動(dòng)脈血管內(nèi)膜中沉積；隨后，機(jī)體募集血液中的單核細(xì)胞遷移入內(nèi)膜，使其激活并分化為AM；AM協(xié)同血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞通過表面受體SR-A識(shí)別并攝入oxLDL，引發(fā)一系列免疫防御和慢性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了AS發(fā)生和發(fā)展[18]。oxLDL與SR-A的結(jié)合是AM成為泡沫細(xì)胞的前提，被認(rèn)為是AS病理進(jìn)程中的關(guān)鍵步驟[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在沒有脂多糖等參與下，高脂兔對(duì)照組SR-A的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組。

SR-A是廣泛分布于AM等非特異性免疫細(xì)胞表面的一類模式識(shí)別受體，其配體具有廣泛性，如oxLDL、LPS、磷壁酸、多聚核苷酸等。一方面，SR-A可以結(jié)合、內(nèi)移、清除LPS，使AM起到抗炎和防御性免疫作用[20]。本實(shí)驗(yàn)中，健康兔AM在Pg-LPS的作用下，SR-A的表達(dá)明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。另一方面，在AS病理過程中，AM上的SR-A可以不受胞內(nèi)脂質(zhì)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)無限制地?cái)z入oxLDL，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇堆積并逐漸分化為AM源性泡沫細(xì)胞[22]。實(shí)驗(yàn)中，高脂狀態(tài)下兔AM受Pg-LPS刺激SR-A的表達(dá)是高脂空白組的3.5倍，是健康兔Pg-LPS組的7倍。因而推測(cè)，牙周致病菌Pg-LPS可以通過刺激AM升高SR-A的表達(dá)，從而促進(jìn)AS的形成。

此外，實(shí)驗(yàn)中加入IL-10后，健康組SR-A的表達(dá)明顯高于單純Pg-LPS組，高脂組SR-A的表達(dá)則明顯低于單純Pg-LPS組，符合文獻(xiàn)報(bào)道的IL-10具有廣泛的抗炎和抗脂質(zhì)代謝的作用[8-9]。

因此，牙周致病菌Pg-LPS誘導(dǎo)的AM膜受體SR-A表達(dá)的升高可能是牙周炎促進(jìn)AS形成的一條重要細(xì)胞學(xué)途徑，其作用機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kuramitsu H K, Qi M, Kang I C,etal. Role for periodontal bacteria in cardiovascular diseases[J].AnnPeriodontol, 2001,6(1):41-47.

[2] Qj M, Miyakawa H, Kuramitsu H K. Porphyromonas gingivalis induces murine macrophage foam cell formation[J].MicrobPathog, 2003,35(6):259-267.

[3] Giacona M B, Papapanou P N, Lamster I B,etal. Porphyromonas gingivalis induces its uptake by human macrophages and promotes foam cell formationinvitro[J].FEMSMicrobiolLett, 2004,241(1):95-101.

[4] Brodala N, Merricks E P, Bellinger D A,etal. Porphyromonas gingivalis bacteremia induces coronary and aortic atherosclerosis in normocholesterolemic and hypercholesterolemic pigs[J].ArteriosclerThrombVascBio1, 2005,25(7):1446-1451.

[5] Wilcox J N, Nelken N A, Coughlin S R,etal. Local expression of inflammatory cytokines in human at herosclerotic plaques[J].JAtherosclerThromb, 1994,1 (Suppl 1):10-13.

[6] Ross R. Atherosclerosis -an inflammatory disease[J].NEnglJMed, 1999,340(2):115-126．

[7] Jozefowski S. The role of the class A scavenger receptors, SR-A and MARCO, in the immune system[J].PostepyHigMedDosw(Online), 2012,66:104-131.

[8] Rubic T, Lorenz R L. Downregulated CD36 and oxLDL uptake and stimulated ABCA1/G1 and cholesterol efflux as anti-atherosclerotic mechanisms of interleukin-10[J].CardiovascRes, 2006,69:527-535.

[9] 周悠嵐, 桂慶軍. 白細(xì)胞介素-10及其基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志, 2011,l3(12):116-118.

[10] 吳春芳, 閆福華. 牙周致病菌Pg-LPS對(duì)組織特異性單核/巨噬細(xì)胞膜表面受體表達(dá)影響的研究[D]. 福建醫(yī)科大學(xué), 2011．

[11] Zhang D, Chen L, Li S,etal. Lipopolysaccharide (LPS) of Porphyromonas gingivalis induces IL-1, TNF-α and IL-6 production by THP-1 cells in a way different from that of Escherichia coli- LPS[J].InnateImmunity, 2008,14(2):99-107.

[12] Cazalis J, Bodet C, Gagnon G,etal. Doxycycline reduces lipopolysaccharide-induced inflammatory mediator secretion inmacrophage andexvivohuman whole blood models[J].JPeriodontol, 2008,79(9):1762-1768.

[13] 單佑安, 秦文利, 蔣建新, 等. IL-10對(duì)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞清道夫受體及CD14表達(dá)的影響[J]．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2003,23(1):44-47.

[14] Libby P. Inflammation in atherosclerosis[J].Nature, 2002,420(6917):868-874.

[15] 戴曉瑋, 鐘良軍. 慢性牙周炎伴冠心病患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中牙齦卟啉單胞菌牙齦素基因片段與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,36(5):644-647.

[16] Culter C W, Shinedling E A, Nunn M,etal. Association between periodontitis and hyperlipidemia: cause or effect[J]?JPeriodontol, 1999,70(12):1429-1434.

[17] Steinberg D. Atherogenesis in perspective: hypereholesterolemia and inflammation as partners in crime[J].NatMed, 2002,8(11):1211-l217.

[18] Tedgui A, Mallat Z. Cytokines in athemsclemsis：pathogenic and regulatory pathways[J].PhysiolRev, 2006,86(2):515-581.

[19] Kujathoor W, Febbraio M, Podrez E A,etal. Scavenger receptors class A-I/II and CD36 are the principal receptors responsible for the uptake of modified low density lipoprotein leading to lipid loading in macrophages[J].JBiolChem, 2002,277(51):49982-49988.

[20] Cotena A, Gordon S, Platt N. The class A macmphage scavenger receptor attenuates CXC chemokine production and the early infiltration of neutmphils in sterile peritonitis[J]．JImmunol, 2004,173(10)：6427-6432．

[21] 王 飛, 戴亞蕾, 徐 婷, 等. LPS和IL-10對(duì)低密度脂蛋白誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成的影響[J]. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2007,28(1):1-5.

[22] Lam M C, Tan K C, Lam K S. Glycoxidized low-density lipopmtein regulates the expression of scavenger receptors in THP-1 macrophages[J].Atherosclerosis, 2004,177(2):313-320.