江鳴濤，唐淑玲，白岳峰，卓孝康，彭東輝

(福建農林大學園林學院，福建 福州 350002)

野牡丹屬植物對大腸桿菌的抑菌效果

江鳴濤，唐淑玲，白岳峰，卓孝康，彭東輝

(福建農林大學園林學院，福建 福州 350002)

以多花野牡丹(Melastoma.affine)為試驗材料，以無菌水為提取劑，通過紙片擴散法對多花野牡丹水提取物進行大腸桿菌的抑菌試驗。采用水浴時間、水浴溫度、料液比3因素3水平正交試驗篩選野牡丹屬(Melastoma)植物葉抑菌物質的最佳提取條件，結果表明：提取溫度60 ℃，浸提時間2 h，料液比1∶30為最佳提取條件；并采用最佳提取條件對部分野牡丹屬植物葉水提取物的抑菌能力進行比較，結果表明：野牡丹屬植物葉的水提取物抑菌能力大小為：毛菍(M.sanguineum)>枝毛野牡丹(M.dendrisetosum)>細葉野牡丹(M.intermedium)>多花野牡丹。

野牡丹屬；大腸桿菌；紙片擴散法；抑菌效果

野牡丹屬(MelastomaL.)植物不僅具有極高的觀賞價值，而且具有較高的藥用價值[1-3]。研究證明野牡丹(Melastomacandidu)、多花野牡丹 (Melastomaaffine)中含有鞣質、酚類及黃酮類等多種生物活性物質，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗血小板聚集、擴張冠狀動脈、自由基清除、抗氧化等功能[4]，臨床使用大都是用水煎液，對大腸桿菌有抑菌作用；動物毒性試驗未見有異常反應[5]。野牡丹屬植物以多花野牡丹分布最廣泛且在臨床上運用較多，具有一定的代表性。多花野牡丹水煎液對大腸桿菌的抑菌物質的最佳提取條件，及同屬的枝毛野牡丹 (M.dendrisetosum)、毛菍 (M.sanguineum)、細葉野牡丹(M.intermedium)水提取物對大腸桿菌的抑菌試驗尚未見報道。鑒于野牡丹屬植物在臨床運用上的巨大潛力，本試驗以多花野牡丹為對象，優(yōu)化野牡丹屬植物葉抑菌物質的提取方法，同時對野牡丹屬的多花野牡丹、毛菍、枝毛野牡丹、細葉野牡丹的葉片水提取物對大腸桿菌的抑菌能力進行比較，以期對野牡丹屬植物藥用價值的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2012年5月在福建農林大學藝術學院、園林學院實驗中心完成。多花野牡丹葉和細葉野牡丹葉采于福建農林大學校內，毛菍葉及枝毛野牡丹葉采集于海南吊羅山國家級自然保護區(qū)。2012年5月采集葉片，將新鮮的葉片洗凈、晾干后放入烘箱中，105 ℃中殺青10 min，然后在60 ℃條件下烘干至恒重，后研磨成粉末，收集于自封袋中，保存在4 ℃的冰箱中備用。

供試菌種：大腸桿菌 (Escherichiacoli)由福建農林大學生命科學學院提供。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 儀器

SW-CJ-2FDA型雙人單面凈化工作臺，DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 多花野牡丹葉抑菌物質的提取 以無菌水為提取溶劑，設水浴時間(A)、水浴溫度(B)、料液比(C)3因素3水平，采用L9(34)正交試驗進行多花野牡丹葉抑菌活性成分的提取。按表1稱取不同質量的多花野牡丹葉片粗粉放入燒杯，并加入相應比例無菌水，密封后置于相應溫度的水浴鍋中進行水浴加熱，控制相應的水浴時間，通過過濾得到9種供試液。

表1 因素水平表

1.3.2 菌懸濁液的制備 大腸桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面活化，擴大培養(yǎng)，24 h后刮取菌苔，然后用無菌生理鹽水配制成 106～107cfu·mL-1菌懸液[6]。

1.3.3 多花野牡丹葉水提取物的抑菌試驗 采用紙片擴散法測定抑菌活性，制備直徑6 mm的濾紙片若干，放入干燥的試管內，經(jīng)121 ℃濕熱滅菌30 min，取出后烘干，浸潤于試液中[7]。在無菌條件下，用移液槍分別移取106～ 107cfu·mL-1的大腸桿菌懸液0.4 mL于9個培養(yǎng)皿中，與45 ℃左右的滅菌培養(yǎng)基20 mL混合，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使兩者充分混合，待含菌培養(yǎng)基凝固后，將浸有不同試液的濾紙片貼于培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基等距放置3個濾紙片，以浸潤無菌水的濾紙片為對照。將培養(yǎng)皿用保鮮膜包裹好并翻轉，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，量取抑菌圈直徑，直徑越大抗菌活性越強。試驗重復3次，計算平均值。

1.3.4 野牡丹屬植物葉水提取物抑菌能力的比較 分別稱取多花野牡丹、細葉野牡丹、枝毛野牡丹、毛菍的葉片粗粉，用無菌水提取，按照多花野牡丹葉提取物抑菌正交試驗所得最佳組合，進行水浴加熱。通過過濾得到4種供試液。在無菌條件下，用移液槍分別移取大腸桿菌懸液0.4 mL于培養(yǎng)皿中，再分別加入相應的葉水提取液1 mL，與45 ℃左右的滅菌培養(yǎng)基20 mL混合，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使兩者充分混合，待含菌培養(yǎng)基凝固后，用保鮮膜包扎好培養(yǎng)皿。將平板反轉在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，采用平板菌落計數(shù)法計算各個培養(yǎng)基的菌落個數(shù)[8]，用l mL無菌水代替葉提取液的平板作為空白對照。試驗重復3次，計算平均值。抑菌率=(空白試驗的菌落數(shù)-加樣試驗的菌落數(shù))/空白試驗的菌落數(shù)。

2 結果與分析

2.1 最佳提取條件篩選

由表2可知，在不同培養(yǎng)條件下，多花野牡丹葉水提取物均有抑菌能力。處理5抑菌圈直徑最大，平均值為8.69 mm；處理6抑菌圈直徑最小，平均值為6.36 mm。極差數(shù)據(jù)表明，料液比對抑菌物質的影響最大，提取時間次之，提取溫度影響最小。多花野牡丹葉抑菌物質的最佳提取組合為處理5(A2B2C3)，即提取時間2 h，溫度60 ℃，料液比1∶30，在該組合條件下多花野牡丹葉抑菌物質對大腸桿菌的抑菌作用最為顯著。

方差分析結果表明：水浴溫度對多花野牡丹葉提取液的抑菌作用影響不顯著(F水浴溫度=5.830F0.05(2，8)=19.0；F料液比=50.635>F0.05(2，8)=19.0)。

表2 不同提取條件對多花野牡丹葉水提取物抑菌能力的影響

表3 不同水浴時間處理的多重比較

*：*為在0.05水平上差異顯著。下同。

表4 料液比水平處理的多重比較

2.2 抑菌能力比較

按照多花野牡丹試驗優(yōu)化所得的最佳提取條件：料液比1∶30、水浴溫度60 ℃、水浴時間2 h，對多花野牡丹、細葉野牡丹、枝毛野牡丹、毛菍的葉片粗粉進行抑菌活性成分提取，并進行抑菌試驗。結果(表5)表明，在相同提取條件下，4種野牡丹屬植物葉提取物抑菌能力大小為：毛菍>枝毛野牡丹>細葉野牡丹>多花野牡丹，抑菌率均大于70%。

表5 不同野牡丹植物葉水提取物抑菌能力比較

3 結論與討論

試驗結果表明，多花野牡丹葉抑菌物質的提取條件的最佳組合為：提取時間2 h，水浴溫度60 ℃，料液比為1∶30；水浴溫度對多花野牡丹葉抑菌物質的提取影響不顯著，水浴時間和料液比則對多花野牡丹抑菌物質的提取影響顯著；水浴時間過長會導致多花野牡丹葉抑菌物質的減少，而在一定范圍內減小料液比的比值則有利于多花野牡丹葉抑菌物質的提取，提高抗菌活性。多花野牡丹、細葉野牡丹、枝毛野牡丹、毛菍對大腸桿菌均有抑制效果，各類野牡丹的葉水提取物抑菌能力大小為：毛菍>枝毛野牡丹>細葉野牡丹>多花野牡丹。

抑菌劑發(fā)揮作用的主要途徑是通過抑制微生物細胞的膜透性或某些酶活性從而抑制代謝過程，也有許多抑菌劑是作為代謝拮抗物影響新陳代謝的進行而發(fā)揮抑菌作用[9]。有關研究表明，通過對多花野牡丹不同部位及不同溶劑進行試驗，表明葉片的抑菌活性物質要高于枝條含量，乙醇對抑菌物質的萃取能力高于無菌水[7]，本試驗則在此基礎上，選擇葉片作為材料，同時采用無菌水作為溶劑，與臨床運用相結合，針對水浴溫度、水浴時間、及料液比進行進一步研究分析，探討三者對抑菌物質提取的影響，對實際藥用具有一定參考價值。通過野牡丹屬植物抑菌能力的比較結果表明毛菍、枝毛野牡丹、細葉野牡丹均有抑菌能力且強于多花野牡丹，具有巨大的開發(fā)潛力和應用價值，今后可以對相關種的抑菌能力和試驗方法進行更深入的探討，進一步開發(fā)野牡丹屬植物的藥用價值。本試驗的結果是通過體外抑菌試驗得到的，野牡丹屬植物在機體內的殺菌效果以及抑菌機理還有待進一步研究。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第53卷：第1分冊[M].北京：科學出版社，1984：156.

[2]國家醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上海科技出版社，2000：675-683.

[3]中國植物志編委會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1984：154-162.

[4]姚亮亮，劉新亞.野牡丹屬植物的化學成分、藥理活性及臨床應用研究概況[J].江西中醫(yī)學院學報，2010，22(6)：52-55.

[5]姚菊玲，唐昌越，何平，等.多花野牡丹治療宮頸糜爛300例臨床觀察[J].河南中醫(yī)，1990，10(5)：24-25.

[6]曾超珍，劉志祥.枸骨葉抑菌物質的提取及抑菌作用研究[J].北方園藝，2009(8)：129-131.

[7]蘇燕評，周孫英，劉劍秋.多花野牡丹的抑菌活性及總黃酮含量測定[J].植物資源與環(huán)境學報，2005，14(1)：56-57.

[8]劉毅，袁月華.幾種常用植物性食物原料成分對大腸桿菌的抑菌作用研究[J].中國調味品，2007(12)：37-40.

[9]林捷，吳錦鑄，朱新貴，等.柚皮提取物的抑菌作用研究[J].華南農業(yè)大學學報，1999，20(3)：59-62.

Study on Bacteriostatic of Melastoma onEscherichiacoli

JIANG Ming-tao，TANG Shu-ling，BAI Yue-feng，ZHUO Xiao-kang，PENG Dong-hui

(LandscapeCollege，F(xiàn)ujianAgriculturalandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，F(xiàn)ujian，China)

Melastomaaffinewas used as test material and the aspetic water was as extractant.The antibacterial activity ofMelastomaaffineleaves to Escherichia coli was studied by disc diffusion method，An orthogonal test which includes water bath time，water bath temperature，and ratio of solid to liquid at three different levels was used to determine the optimum extractive condition of antifungal substance ofMelastomaleaves.The results showed that the optimum extractive conditions was leaching-temperature 60 ℃，extracting time 2h，ratio of solid to liquid 1∶30.Under the optimum extractive condition，the antibacterial activity of parts ofMelastomaL. leaves were compared，the result showed the ability of bacteriostatic wasM.sanguineum>M.dendrisetosum>M.intermedium>M.affine.

MelastomaL.；Escherichiacoli；disc diffusion method；bacteriostatic effect

10.13428/j.cnki.fjlk.2014.03.014

2013-09-10；

2013-10-28

福建省林業(yè)廳資助項目(野牡丹科植物種質資源保護與利用推廣，閩林推[2011]5號)

江鳴濤(1990—)，男，福建平和人，福建農林大學園林學院在讀碩士研究生，從事園林植物研究。E-mail：601695833@qq.com。

彭東輝(1971—)，男，福建屏南人，福建農林大學園林學院教授，博士，從事園林植物資源與應用研究。E-mail：fjpdh@126.com。

S767.1+6；Q946.887

A

1002-7351(2014)03-0061-04