劉忠錦,張海燕,劉佳俊Δ,劉子慧

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 組胚教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

石杉?jí)A甲對(duì)血管性癡呆大鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)及氧化應(yīng)激水平的影響

劉忠錦1,張海燕2,劉佳俊1Δ,劉子慧1

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 組胚教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探索石杉?jí)A甲（huperzine A)對(duì)血管性癡呆大鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的表達(dá)及氧化應(yīng)激水平的影響。方法 雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、石杉?jí)A甲組，每組12只。模型組和石杉?jí)A甲組采用大腦中動(dòng)脈永久性缺血模型，造模后7 d石杉?jí)A甲組開(kāi)始給藥，0.1mg/（kg·d)，每天1次，連續(xù)灌胃給藥30 d，正常對(duì)照組和模型組給予等容量蒸餾水。觀察各組動(dòng)物行為學(xué)變化、檢測(cè)腦組織勻漿中乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE)、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA)、一氧化氮（nitric oxide，NO)含量；觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化；原位雜交法檢測(cè)GDNFmRNA的含量。結(jié)果 石杉?jí)A甲可以縮短模型大鼠學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間，延長(zhǎng)記憶時(shí)間，減少錯(cuò)誤次數(shù)（P＜0.05)；增強(qiáng)大鼠腦組織中SOD活性，降低膽堿酯酶活性，MDA和NO含量減少（P＜0.05)；形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示:石杉?jí)A甲對(duì)血管癡呆大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元有一定的改善作用；與模型組比較，石杉?jí)A甲組大鼠海馬GDNFmRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)論 石杉?jí)A甲可顯著改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制可能與石杉?jí)A甲能增強(qiáng)腦組織SOD活性，降低膽堿酯酶活性，減少M(fèi)DA和NO含量，從而提高了腦組織的抗氧化水平，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

石杉?jí)A甲；血管性癡呆；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由于各種腦血管病引起腦功能障礙而產(chǎn)生的智能損害性疾病,癡呆為主要臨床表現(xiàn)。隨著社會(huì)老齡化加重,血管性癡呆作為我國(guó)老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)?。?］,其發(fā)病率呈上升趨勢(shì),占我國(guó)老年癡呆病60%左右。研究表明［2-3］,石杉?jí)A甲(huperzine A)具有保護(hù)腦組織,免受自由基損傷,發(fā)揮抗衰老的作用。為深入探討其作用機(jī)制,本文采用大腦中動(dòng)脈永久性缺血的血管性癡呆大鼠模型,旨在探討石杉?jí)A甲對(duì)VD模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康SD雄性大鼠36只,體質(zhì)量180～220 g,試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,由白求恩醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)2011-004,自由進(jìn)食進(jìn)水,12 h光照/黑暗周期,環(huán)境溫度(22±1)℃,所使用的動(dòng)物遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2 藥物試劑與儀器 石杉?jí)A甲片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,批號(hào):H10960133),GDNF原位雜交檢測(cè)試劑盒(博士德生物工程有限公司)?？捡R斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、NO測(cè)定試劑盒、乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)試劑盒,均由南京建成生物工程研究所提供。Morris水迷宮由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院治療所生產(chǎn)。FA1004型電子天平(上海天平儀器廠)。LD5.2A型超速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.3 模型制作 參照田金洲［4］制作大腦中動(dòng)脈永久性缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。?%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg,ip)將大鼠麻醉,固定后常規(guī)消毒,取頸部切口,鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及頸外動(dòng)脈(ECA),永久結(jié)扎同側(cè)頸總動(dòng)脈,將CCA的ECA與ICA分叉處剪一小口并迅速沿ICA順行插入栓線,推進(jìn)大腦中動(dòng)脈(MCA)至17～20mm時(shí)停止推送,達(dá)到大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血目的。動(dòng)物模型納入標(biāo)準(zhǔn):動(dòng)物麻醉清醒后出現(xiàn)對(duì)側(cè)前肢倦曲或行走轉(zhuǎn)圈體征,動(dòng)物無(wú)以上體征或2 h后仍不清醒者剔除［5］。

1.4 分組與給藥 選擇36只合格大鼠,隨機(jī)均分為正常組和模型組、石杉?jí)A甲組,每組12只。模型組、石杉?jí)A甲組采用大腦中動(dòng)脈永久性缺血模型,造模后7 d開(kāi)始灌胃給藥,其中石杉?jí)A甲組給予石杉?jí)A甲片混懸液0.1mg/(kg·d),ig,連續(xù)給藥30 d;正常對(duì)照組和模型組給予等容量蒸餾水。

1.5 大鼠行為學(xué)檢測(cè) 治療前后Morris水迷宮檢測(cè)每組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。①定位航行試驗(yàn):經(jīng)歷5 d,每日上、下午分別測(cè)試1次,將大鼠分別從4個(gè)不同象限放入水中,記錄大鼠在2min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(即為逃避潛伏期);在2 min內(nèi)未能找到平臺(tái),潛伏期記錄為120 s。通過(guò)定位航行試驗(yàn)觀察大鼠逃避潛伏期的長(zhǎng)短檢測(cè)其學(xué)習(xí)能力;②空間探索試驗(yàn):第6天拆除平臺(tái),將大鼠從任意一點(diǎn)放入水中,觀察大鼠2 min內(nèi)在池中的游泳軌跡,記錄大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè) 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束24 h后,給予動(dòng)物4%多聚甲醛灌注20min。斷頭取各組大鼠腦組織,從下丘腦中部切為2部分,前半部分在冰浴下用勻漿器勻漿,用生理鹽水制成10%的組織勻漿,4℃3000 r/min離心10min,取上清液檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明,檢測(cè)腦組織SOD和膽堿酯酶活性及MDA和NO含量。

1.7 形態(tài)學(xué)檢查 后半部腦組織放入10%甲醛溶液中固定。亞甲藍(lán)染色,對(duì)海馬區(qū)進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.8 原位雜交法測(cè)定大鼠海馬GDNFmRNA 參照GDNF原位雜交檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,切片經(jīng)二甲苯脫蠟,酒精水化,滴加5μg/mL胃蛋白酶,37℃孵育25min來(lái)滅活內(nèi)源性酶。加入20μL預(yù)雜交液,靜置2 h,滴入雜交液20μL后孵化18 h;加入生物素化鼠抗地高辛標(biāo)記DNA探針,然后滴加顯色液,37℃生物素化過(guò)氧化物酶30min,常規(guī)脫水、透明及封片。用PBS代替探針作陰性對(duì)照。用Image-ProPlus圖像分析軟件對(duì)GDNF mRNA結(jié)果分析,各組切片取8個(gè)不同視野測(cè)定積分吸光度,吸光度值越大表示陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)越強(qiáng),取平均值代表GDNFmRNA表達(dá)強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行處理,正態(tài)計(jì)量資料以“±s”表示,組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料組間率的比較采用χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石杉?jí)A甲對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)的影響 模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)并且跨越平臺(tái)次數(shù)減少,與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);治療后石杉?jí)A甲組逃避潛伏期顯著縮短且跨越平臺(tái)次數(shù)增加,與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示石杉?jí)A甲具有改善VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用(見(jiàn)表1)。

表1 石杉?jí)A甲對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)的影響Tab.1 Effect of huperzine A on VD rats

2.2 石杉?jí)A甲對(duì)血管癡呆大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響

正常組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞數(shù)目多,邊界整齊,神經(jīng)元胞體中核大而圓,核仁清楚。模型組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞稀疏,尼氏體消失,核深染固縮,有些神經(jīng)元旁邊出現(xiàn)空染區(qū)。石杉?jí)A甲組大鼠海馬區(qū)正常神經(jīng)元數(shù)目較多,排列比較整齊,但少量細(xì)胞出現(xiàn)核內(nèi)染色質(zhì)濃縮見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠形態(tài)學(xué)染色結(jié)果(×400)Fig.1 Morphology staining results of ras in three group(×400)

2.3 石杉?jí)A甲對(duì)血管性癡呆大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響 與正常組比較,模型組大鼠腦組織SOD活性明顯下降,膽堿酯酶活性升高,MDA和NO含量明顯增加;與模型組比較,石杉?jí)A甲組可以升高血管癡呆大鼠腦組織SOD活性,降低膽堿酯酶活性,減少M(fèi)DA和NO含量,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見(jiàn)表2)。

表2 石杉?jí)A甲對(duì)血管性癡呆大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響Tab.2 Effect of huperzine A on oxidative stress level in VD rats

2.4 石杉?jí)A甲對(duì)大鼠海馬GDNFmRNA的影響 與正常組大鼠比較,模型組大鼠海馬GDNFmRNA表達(dá)降低明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,石杉?jí)A甲組大鼠海馬GDNFmRNA表達(dá)提升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見(jiàn)表3、圖 2)。

表3 原位雜交法測(cè)定各組大鼠海馬GDNFmRNA比較Tab.3 Comparison of GDNFmRNA in hippocampal by situ hybridization

圖2 原位雜交各組GDNFmRNA的表達(dá)(×400)Fig.2 Expression of GDNFmRNA by situ hybridization in groups(×400)

3 討論

石杉?jí)A甲是從草藥千層塔中分離得到的一種新型石松類生物堿［6-7］,是一種高效可逆的膽堿酯酶抑制劑,脂溶性較高,分子量小,易透過(guò)血腦屏障,進(jìn)入中樞后分布于大腦顳葉、海馬等部位,能增加突觸間隙內(nèi)乙酰膽堿含量,彌補(bǔ)乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的缺損。此藥具有抗氧自由基,保護(hù)大腦缺氧、缺血損傷,增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的作用［8］。且作用時(shí)間長(zhǎng),反復(fù)給藥沒(méi)有依賴性,較大劑量給藥也無(wú)明顯的肝毒性［9］。水迷宮結(jié)果顯示,VD模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降,而給予石杉?jí)A甲后逃避潛伏期明顯縮短而且跨越平臺(tái)次數(shù)增加,提示石杉?jí)A甲對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退有一定的預(yù)防和改善作用。

本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈永久性缺血制備VD模型,模型組出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶損害,而無(wú)明顯的運(yùn)動(dòng)障礙,其海馬組織學(xué)切片顯示神經(jīng)元凋亡。此造模方法簡(jiǎn)單,重復(fù)性較好,動(dòng)物死亡率低,能較好地模擬人類VD的發(fā)生［10］。

自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化和過(guò)氧化反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中、神經(jīng)退行性病變等疾病起到重要的作用［11］。SOD是一種金屬蛋白酶,能清除超氧陰離子自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用,提高體內(nèi)SOD含量,從而保護(hù)細(xì)胞免受自由基的傷害。MDA是不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物,測(cè)定MDA含量變化可反應(yīng)機(jī)體自由基損傷的程度［12］。因此SOD活性和MDA含量的變化可直接評(píng)價(jià)腦組織損傷程度和藥物療效。

NO是一種具有重要生物活性的信號(hào)分子,具有調(diào)節(jié)腦血流、促進(jìn)或抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放、參與突觸可塑性等多種作用,且與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)［13］。腦組織是對(duì)缺血缺氧最敏感的部位,當(dāng)腦缺血缺氧時(shí),離子泵功能障礙并釋放興奮性氨基酸,大量Ca2+內(nèi)流,NOS的持續(xù)性激活和釋放,導(dǎo)致NO含量的升高［14］。NO是神經(jīng)活性物質(zhì),在血管癡呆中有重要作用。乙酰膽堿是形成記憶的神經(jīng)遞質(zhì),它由膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)合成,膽堿酯酶(AchE)分解。大腦缺血后中樞膽堿能神經(jīng)元受損,突觸數(shù)量減少導(dǎo)致ACh遞質(zhì)減少。因此減弱乙酰膽堿酯酶(AChE)活性,有助于改善血管性癡呆的記憶障礙。

GDNF在腦缺血后神經(jīng)元損傷的修復(fù)以及認(rèn)知功能的恢復(fù)中都有重要作用［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:大鼠在慢性腦缺血后GDNF表達(dá)下降,石杉?jí)A甲治療后表達(dá)增高,能減輕損傷程度并促進(jìn)后期神經(jīng)功能的恢復(fù),石杉?jí)A甲可以使血管癡呆大鼠腦組織SOD活性升高,膽堿酯酶活性下降,MDA含量和NO含量減少。石杉?jí)A甲對(duì)血管癡呆大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化有一定的改善。說(shuō)明石杉?jí)A甲能夠抗氧化、清除自由基,對(duì)血管性癡呆大鼠神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)有重要作用。

綜上所述,石杉?jí)A甲可顯著改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙［16-17］,其機(jī)制可能與石杉?jí)A甲能增強(qiáng)腦組織SOD活性、降低膽堿酯酶活性、減少M(fèi)DA和NO含量,從而提高腦組織的抗氧化水平,發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

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(編校:吳茜)

Effect of huperzine A on glial cell line derived neurotrophic factor expression and oxidative stress level in vascular dementia rat

LIU Zhong-jin1,ZHANG Hai-yan2,LIU Jia-jun1Δ,LIU Zi-hui1

(1.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College,Qiqihar 161006,China;
2.Department of Histology and Embryology,Qiqihar Medical College,Qiqihar 161006,China)

Objective To observe the effect of huperzine A on glial cell line derived neurotrophic factor(GDNF)expression and oxidative stress level in vascular dementia rat.Methods 36 male SD rats were random ly divided into three groups:normal group,model group and huperzine A group,each group had 12 rats.Permanentmiddle cerebralartery ischemiamodelwere established with rats inmodelgroup and huperzine A group.7 days latter,rats of huperzine A group were given gastric perfusion huperzine A 0.1mg/(kg·d),ig,once a day for 30 days.The normal control group and model group ratswere given equal volume of distilled water.Animal's behavior,related biochemical indicators and AChE and SOD activity level in all groups were observed,MDA and NO contents in the brain were determined.The changes of pathomorphology were observed by HE staining.The expression of GDNFmRNA were tested by situ hybridization.Results Huperzine A could shorten the reaction time of learning,prolong the latent time ofmemory,reduce times ofmistakes,raise the SOD activity of brain tissue,decrease MDA and NO content,restrain the activity of AChE(P＜0.05).The pathology results showed that therewas an improvement in the pathological changes of cortex and hippocampus of vascular dementia rats brain tissue.Compared with themodel group,the expression of rats'hippocampus GDNF mRNA in huperzine A group was obviously improved,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion Huperzine A can significantly improve the vascular dementia rats learning and memory impairment,itsmechanism may be related to that huperzine A can enhance brain tissue SOD activity and reduce the cholinesterase activity,reduce the content of MDA and NO,thus improve the antioxidant levels of brain tissue,exert its nerve protective effect.

huperzine A;vascular dementia;glial cell line derived neurotrophic factor

R739

A

1005-1678（2014)06-0044-04

齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(SFZD-2013111)

劉忠錦，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治老年癡呆，E-mail：23741166@qq.com；劉佳俊，通信作者，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治老年癡呆，E-mail：13946231606@163.com。