艾文超，李海山，劉偉，宋乃寧，程艷，崔媛，李蕾，謝文平，陳會明

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 化學(xué)品安全研究所，北京 100123

免疫毒性評價中不同淋巴細(xì)胞激活劑致大鼠外周全血產(chǎn)生細(xì)胞因子作用的評價

艾文超，李海山，劉偉，宋乃寧，程艷，崔媛，李蕾，謝文平，陳會明*

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 化學(xué)品安全研究所，北京 100123

淋巴細(xì)胞激活劑可有效活化免疫細(xì)胞，進而促進細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌，但不同激活劑及激活方式的選擇直接影響細(xì)胞因子產(chǎn)生的種類和水平。為評價不同激活劑促細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，篩選一種快速有效的激活方法用于細(xì)胞因子檢測，本研究采用不同濃度佛波酯(PMA)/鈣離子載體、植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)和美洲商陸素(PWM)體外激活大鼠外周全血0、2、4、6、8、10 h，對各樣本中10種細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、白細(xì)胞介素13(IL-13)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達和分泌因子(RANTES)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β))含量進行檢測，并評價了環(huán)孢素A和硫唑嘌呤2種免疫抑制劑對激活劑誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子的抑制作用。結(jié)果表明25 ng·mL-1PMA和1 μg·mL-1鈣離子載體體外誘導(dǎo)6 h可以顯著升高大鼠外周全血IL-2、IFN-γ、TNF-α、RANTES和TGF-β含量，是一種作用廣泛的激活方法。其誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子作用的變化可反映機體免疫系統(tǒng)和功能的損傷，可有效用于外源化學(xué)物免疫毒性評價。

淋巴細(xì)胞激活劑；細(xì)胞因子；外周全血；懸浮芯片系統(tǒng)；免疫毒性評價

細(xì)胞因子是一種小分子量的蛋白或多肽，主要由活化的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，在所有的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，其含量及活性的變化能夠反映機體免疫系統(tǒng)和功能的損傷，已成為一種有效的體外免疫功能性試驗方法[1-3]。

由于休眠狀態(tài)的免疫細(xì)胞只生產(chǎn)少量的細(xì)胞因子來滿足其基本生理需求，循環(huán)血中的細(xì)胞因子水平并不能反應(yīng)免疫系統(tǒng)功能，且細(xì)胞因子低濃度水平下的微小變動也很難解釋其生物學(xué)意義，有時甚至難以檢測，所以在細(xì)胞因子檢測時通常需要使用淋巴細(xì)胞激活劑對外周全血或淋巴細(xì)胞進行體外激活。常用的激活劑包括：植物凝集素(如植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(Con A)、美洲商陸素(PWM))，脂多糖(LPS)，佛波酯(PMA)/鈣離子載體，結(jié)核菌素純蛋白衍生物，T淋巴細(xì)胞亞群(CD3/CD28)抗體等[4]。然而，不同激活劑的選擇可能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生不同種類的細(xì)胞因子，且激活劑濃度及激活時間對細(xì)胞因子產(chǎn)生水平也有影響。研究人員曾通過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，PHA是誘導(dǎo)人外周全血產(chǎn)生多種細(xì)胞因子的最佳激活劑[5]，但各激活劑的作用可能存在種屬差異，對不同激活劑誘導(dǎo)嚙齒類動物外周全血產(chǎn)生細(xì)胞因子作用的比較研究還沒有文獻報道，給非臨床免疫毒性評價工作者在激活劑的選擇上帶來很大的困惑。

因此，本研究評價了不同種類及濃度的淋巴細(xì)胞激活劑作用不同時間后，對SD大鼠外周全血中釋放細(xì)胞因子的影響，以及不同免疫抑制劑對淋巴細(xì)胞激活劑促細(xì)胞因子生成作用的影響。以期篩選一種快速有效的激活方法用于細(xì)胞因子檢測，為其在非臨床免疫毒性評價中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究資料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋公司)，3-18k型冷凍離心機(SIGMA公司)，Bio-Plex 200型懸浮芯片系統(tǒng)(伯樂公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司)。

試劑：細(xì)胞因子檢測multi-plex試劑盒購自Affymetrix公司。Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Calbiochem公司。植物凝集素(PHA)，脂多糖(LPS)，刀豆蛋白A(Con A)，美洲商陸素(PWM)，佛波酯(PMA)/鈣離子載體均購自SIGMA公司。環(huán)孢素A(CsA)和硫唑嘌呤(AZP)均購自武漢遠城科技發(fā)展有限公司，純度分別為99.6%和98.5%。

1.2 實驗材料

肝素鈉抗凝外周全血采自正常健康或免疫抑制劑給藥1周后的雌性SD大鼠。動物購自北京維通利華實驗動物公司，合格證號SCXK-2012-0001，體重240～260 g，自由攝食飲水。

1.3 外周全血體外刺激

200 μL未稀釋肝素鈉抗凝全血加入試管中，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下，與不同濃度和類別的淋巴細(xì)胞激活劑共同培養(yǎng)0、2、4、6、8、10 h后，離心收集上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞因子測定方法

使用Bio-Plex 200懸浮芯片系統(tǒng)同時檢測10種細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達和分泌因子(RANTES)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)。該方法基本原理為蛋白質(zhì)夾心酶聯(lián)免疫方法，使用不同熒光微球進行細(xì)胞因子的篩選和定量，細(xì)胞因子檢測范圍可至1～32 000 pg·mL-1，具有通量高，靈敏度高的特點。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果通過SPSS 10.0軟件進行單因素方差分析。最小顯著性差法(LSD)，Dunnett和Games-Howell檢驗用于比較組間差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 淋巴細(xì)胞激活劑誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的時間-反應(yīng)和劑量-反應(yīng)關(guān)系

為評價各激活劑在不同濃度和激活時間下的作用，檢測了5種激活劑(PHA、LPS、Con A、PWM、PMA/鈣離子載體)在3種濃度(PMA終濃度為1、5、25 ng·mL-1；鈣離子載體1 μg·mL-1；其他均為1、5、10 μg·mL-1)下，對SD大鼠外周全血刺激0、2、4、6、8、10 h后，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用(圖1)，發(fā)現(xiàn)25 ng·mL-1的PMA和1 μg·mL-1的鈣離子載體聯(lián)用6 h后即可顯著激活大鼠外周全血產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括IL-2、IFN-γ、TNF-α、TGF-β和RANTES，8 h后可檢測到IL-4、IL-6增多，但作用不明顯。其他激活劑雖然也能呈劑量和時間依賴性地促進某些細(xì)胞因子的釋放，但所激活產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類較少(值得注意的是LPS能夠?qū)NF-α產(chǎn)生非常強烈的促分泌作用)。因此在本研究中，筆者認(rèn)為PMA/鈣離子載體是最有效的激活劑，并以25 ng·mL-1的PMA和1 μg·mL-1的鈣離子載體的6 h刺激進行免疫抑制藥物的評價實驗。

圖1 淋巴細(xì)胞激活劑誘導(dǎo)大鼠外周全血產(chǎn)生細(xì)胞因子注：PMA、PHA、Con A、LPS和PWM分別為：佛波酯、植物血凝素、刀豆蛋白A、脂多糖和美洲商陸素。 PMA/鈣離子載體中，鈣離子載體濃度為1 μg·mL-1。Fig. 1 Rat blood immune cells showed altered cytokine production in response to different lymphocyte stimulantsNote: PMA, PHA, Con A, LPS and PWM are phorbol-12-myristate-13-acetate, phytohaemagglutinin, concanavalin A, lipopolysaccharide and pokeweed-mitogen. The concentration of ionomycin is 1 μg·mL-1 in PMA/Ionomycin.

在評估外源化學(xué)物免疫毒性之前，有必要對指定激活劑量和刺激時間下細(xì)胞存活率進行檢測。如果免疫細(xì)胞因為營養(yǎng)不足或紅細(xì)胞破裂而死亡，將影響細(xì)胞因子產(chǎn)生，使對免疫抑制結(jié)果的判斷不準(zhǔn)確。為此，含有25 ng·mL-1的PMA和1 μg·mL-1的鈣離子載體的正常健康大鼠全血在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心提取外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。用Annexin-V/PI雙染色，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，加PMA/鈣離子載體和正常樣本中雙陰性細(xì)胞比例分別為84.68%和86.51%(數(shù)據(jù)未顯示)，表明在此培養(yǎng)狀態(tài)下，全血中大多數(shù)細(xì)胞均處于存活狀態(tài)。

2.2 免疫抑制劑對細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用

為了判斷不同外源化學(xué)物是否能影響PMA和鈣離子載體聯(lián)用的促細(xì)胞因子生成作用，選擇環(huán)孢素A(CsA)和硫唑嘌呤(AZP)2種臨床常用的免疫抑制劑作為受試物，二者均具有抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生作用，但作用機制不同。環(huán)孢素A會和胞質(zhì)內(nèi)的免疫親和素(親環(huán)素)結(jié)合，形成復(fù)合物，作用于鈣調(diào)磷酸酶，使磷酸酶結(jié)合于免疫親和素上，進而不能影響下游的轉(zhuǎn)錄因子(如NF-AT)，最終阻止了多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。硫唑嘌呤則對細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞具有直接毒性[6]。

由于體內(nèi)給藥比體外培養(yǎng)中加入受試藥物更能夠反映動物整體免疫功能受到的影響，所以試驗選用3種濃度的受試物(環(huán)孢素A：1.25、5、20 mg·kg-1；硫唑嘌呤：1、5、25 mg·kg-1)對大鼠進行灌胃給藥，高劑量均為動物的最大耐受劑量[7]，另設(shè)溶媒(橄欖油)對照組，每組3只動物。連續(xù)給藥7 d后，取肝素鈉抗凝全血加25 ng·mL-1的PMA和1 μg·mL-1的鈣離子載體培養(yǎng)6 h后，Muti-plex檢測IFN-γ、IL-2、RANTES、TGF-β和TNF-α細(xì)胞因子含量。結(jié)果顯示，2種免疫抑制劑對細(xì)胞因子的影響是與給藥劑量相關(guān)的。但二者的抑制效果不同，環(huán)孢素A能夠顯著抑制淋巴細(xì)胞激活劑誘導(dǎo)的IL-2、RANTES、TGF-β、TNF-α和IFN-γ產(chǎn)生；而硫唑嘌呤則對促IFN-γ生成的抑制作用較弱(圖2和圖3)。

圖2 環(huán)孢素A(CsA)對細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響注：Mean±SD，n=3；*p<0.05，**p<0.01。Fig. 2 Cytokine secretion was inhibited by cyclosporine A (CsA) at different concentrationsNote: Mean±SD, n=3;*p< 0.05, **p<0.01.

圖3 硫唑嘌呤(AZP)對細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響注：Mean±SD，n=3；*p<0.05，**p<0.01。Fig. 3 Cytokine secretion was inhibited by of azathioprine (AZP) at different concentrationsNote: Mean±SD, n=3;*p< 0.05, **p<0.01.

3 討論(Discussion)

在體外刺激試驗中，常用的檢測樣本為外周血單核細(xì)胞(PBMCs)或稀釋全血，但分離和培養(yǎng)過程可能損失重要的免疫分子和受試物，破壞免疫細(xì)胞之間的分子網(wǎng)絡(luò)[8-9]。因此，這些方法可能無法模擬體內(nèi)免疫系統(tǒng)環(huán)境。筆者認(rèn)為未稀釋全血培養(yǎng)是研究體外活化細(xì)胞和產(chǎn)生細(xì)胞因子的最佳環(huán)境。但需要注意的是外周全血刺激的主要缺點在于細(xì)胞數(shù)量不確定，且不好控制，需要在今后的研究中對細(xì)胞數(shù)量進行標(biāo)準(zhǔn)化。

此外，免疫反應(yīng)涉及多種細(xì)胞因子復(fù)雜的相互作用，而細(xì)胞因子種類繁多，在本研究中選擇哪些“合適的”細(xì)胞因子進行檢測呢？House[6]的研究表明，適用于免疫毒性研究的細(xì)胞因子分為以下幾類：1) 前炎癥細(xì)胞因子：IL-1、IL-6、TNF；2) TH1/TH2類細(xì)胞因子：IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β；3) IL-1受體拮抗劑(IL-1RA)；4) 趨化因子：IL-8、MIP(巨噬細(xì)胞炎癥蛋白)、RANTES；5) 促紅細(xì)胞生成素：GM-CSF、IL-3；6) 干擾素：I型干擾素(IFN-α、IFN-β)，II型干擾素(IFN-γ)；7) 其他：IL-9、IL-13、IL-14、致癌蛋白M、白血病抑制因子、白細(xì)胞調(diào)節(jié)素。受現(xiàn)有大鼠細(xì)胞因子Multi-plex試劑盒檢測種類限制，本研究在上述類別中選擇了IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、RANTES和TGF-β共10種免疫相關(guān)的細(xì)胞因子進行檢測。

在本研究中，盡管發(fā)現(xiàn)Con A、PHA、PWM和LPS也可在體外刺激產(chǎn)生不同細(xì)胞因子，但PMA/鈣離子載體是最有效的激活劑。PMA/鈣離子載體體外刺激大鼠外周全血6 h后，即可使IL-2、IFN-γ、TNF-α、TGF-β和RANTES顯著增加，但對IL-4、IL-6、IL-10、IL-13和GM-CSF的影響較弱。這說明PMA/鈣離子載體促細(xì)胞因子生成作用存在一定的選擇性，許多臨床試驗也證實了這點。 Barten等[10]在健康人未稀釋抗凝全血中加入25 ng·mL-1PMA和750 ng·mL-1鈣離子霉素體進行體外培養(yǎng)，5 h后，IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-6顯著增加，但IL-4和IL-10并未出現(xiàn)明顯增多。 Keski-Nisula等[11]的研究中使用15 ng·mL-1PMA和1 μg·mL-1鈣離子載體對培養(yǎng)液稀釋的人外周全血體外刺激24 h(較長的體外刺激時間可能是因為樣本處理過程中消除或稀釋了一些與免疫細(xì)胞相關(guān)的活性成分)，也發(fā)現(xiàn)除IL-4外，IFN-γ、IL-6和TNF-α的含量均顯著增加。人CD4+T細(xì)胞經(jīng)PMA/鈣離子載體刺激后，也并未產(chǎn)生IL-10的高表達[12]。與PHA體外刺激人外周全血的研究結(jié)果不同[4]，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)PHA對大鼠外周全血中IFN-γ、IL-10、IL-4、IL-6和TNF-α生成的顯著促進作用，僅觀察到其能夠使IL-2、IL-13和RANTES含量增加，這表示激活劑的促細(xì)胞因子生成作用仍然表現(xiàn)出種屬差異，當(dāng)然也可能與試驗條件的差異有關(guān)。在評價不同免疫抑制劑對PMA/鈣離子載體促細(xì)胞因子生成作用的影響時，不同免疫抑制劑表現(xiàn)出不同的抑制作用。環(huán)孢素A抑制了大多數(shù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而硫唑嘌呤對IFN-γ的抑制效果較弱。之前的研究也發(fā)現(xiàn)他克莫司、地塞米松和霉酚酸對激活全血體外細(xì)胞因子的釋放具有截然不同的影響[5]。這說明，淋巴細(xì)胞激活劑促細(xì)胞因子產(chǎn)生水平的變化，可以反映出外源化學(xué)物對免疫系統(tǒng)和功能產(chǎn)生的不同作用，并能夠?qū)Σ煌瘜W(xué)物的特性進行鑒定。

綜上所述，筆者認(rèn)為25 ng·mL-1PMA和1 μg·mL-1鈣離子載體聯(lián)用體外誘導(dǎo)6 h，可促進大鼠外周全血中產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，具有簡單、快速、靈敏和作用廣泛等特點。其促細(xì)胞因子生成作用的變化能夠反映機體免疫系統(tǒng)和功能的損傷，可有效用于外源化學(xué)物免疫毒性評價。

[1] Van der Meide P H, Schellekens H. Cytokines and the immune response [J]. Biotherapy, 1996, 8: 243-249

[2] Corsini E, Roggen E L. Immunotoxicology: Opportunities for non-animal test development [J]. Alternatives to Laboratory Animals, 2009, 37(4): 387-397

[3] Galbiati V, Mitjans M, Corsini E. Present and future of in vitro immunotoxicology in drug development [J]. Journal of Immunotoxicology, 2010, 7(4): 255-267

[4] Corsini E, House R V. Evaluating cytokines in immunotoxicity testing [J]. Methods in Molecular Biology, 2010, 598: 283-302

[5] Liu Z, Yuan X, Luo Y, et al. Evaluating the effects of immunosuppressants on human immunity using cytokines profiles of whole blood [J]. Cytokines, 2009, 45(2): 141-147

[6] House R V. Theory and practice of cytokines assessment in immunotoxicology [J]. Methods, 1999, 19(1): 17-27

[7] De Waal E J, Timmerman H H, Dortant P M, et al. Investigation of a screening battery for immunotoxicity of pharmaceuticals within a 28-day oral toxicity study using azathioprine and cyclosporin A as model compounds [J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 1995, 21(3): 327-338

[8] Foster J R. The functions of cytokines and their uses in toxicology [J]. International Journal of Experimental Pathology, 2001, 82(3): 171-192

[9] Myrianthefs P, Karatzas S, Venetsanou K, et al. Seasonal variation in whole blood cytokines production after LPS stimulation in normal individuals [J]. Cytokines, 2003, 24(6): 286-292

[10] Barten M J, Rahmel A, Bocsi J, et al. Cytokines analysis to predict immunosuppression [J]. International Society for Analytical Cytology, 2006, 69(3): 155-157

[11] Keski-Nisula L, Roponen M, Hirvonen M R, et al. Stimulated cytokines production correlates in umbilical arterial and venous blood at delivery [J]. European Cytokine Network, 2004, 15(4): 347-352

[12] Olsen I, Sollid L M. Pitfalls in determining the cytokines profile of human T cells [J]. Journal of Immunological Methods, 2013, 390(1-2): 106-112

◆

EvaluationonCytokineProductioninRatPeripheralWholeBloodInducedbyDifferentLymphocyteStimulantsinImmunotoxicityBioassay

Ai Wenchao, Li Haishan, Liu Wei, Song Naining, Cheng Yan, Cui Yuan, Li Lei, Xie Wenping, Chen Huiming*

Institute of Chemicals Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine (CAIQ), Beijing, 100123, China

10 May 2013accepted8 September 2013

Lymphocyte stimulants can effectively promote the production and release of several cytokines by activating the immune cells, but the types and levels of cytokines depend on the kinds of stimulants. To study the activation effects of different lymphocyte stimulants on cytokine production, the authors analyzed the production of interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), interleukin-13 (IL-13), interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor α (TNF-α), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor (RANTES) and transforming growth factor β (TGF-β) in undiluted rat peripheral whole blood after in vitro culture (0, 2, 4, 6, 8, 10 h) with different concentrations of phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)/Ionomycin, phytohaemagglutinin (PHA), concanavalin A (Con A), lipopolysaccharide (LPS) and pokeweed-mitogen (PWM). Besides, the effects of immunosuppressants (cyclosporine A and azathioprine) on cytokines production induced by the above lymphocyte stimulants were also studied. The results showed that a rapid increase of cytokine (including IL-2, IFN-γ, TNF-α, RANTES and TGF-β) secretion within 6 h after stimulation with 25 ng·mL-1PMA and 1 μg·mL-1ionomycin. The inhibition of these cytokine profiles reflected the effects of xenobiotics on immune system. Therefore, simultaneous detection of cytokine profiles in undiluted whole blood stimulated with PMA/Ionomycin is a powerful tool for immunotoxicity assessment.

lymphocyte stimulant; cytokines; whole blood; suspension array system; immunotoxicity assessment

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(2012JK024)

艾文超(1985-)，男，碩士，研究方向為毒理學(xué)，E-mail: aiwch@aqsiqch.ac.cn；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: chenhm@aqsiqch.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130510001

艾文超，李海山，劉偉，等. 免疫毒性評價中不同淋巴細(xì)胞激活劑致大鼠外周全血產(chǎn)生細(xì)胞因子作用的評價[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2014, 9(2): 239-244

Ai W C, Li H S, Liu W, et al. Evaluation on cytokine production in rat peripheral whole blood by different lymphocyte stimulants in immunotoxicity bioassay [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 239-244 (in Chinese)

2013-05-10錄用日期2013-09-08

1673-5897(2014)2-239-06

X171.5

A

陳會明(1969—)，男，環(huán)境科學(xué)博士，研究員，主要從事化學(xué)品理化安全、毒性、生態(tài)安全測試技術(shù)和風(fēng)險分析技術(shù)研究。