盧慶華+邢孟蘭+蔡祿

摘要：采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)青霉菌產(chǎn)漆酶的優(yōu)化條件進(jìn)行研究，并測(cè)定了青霉菌對(duì)蘆葦木質(zhì)素的降解率。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)條件為麥麩17 g/L，酵母膏2 g/L，Al3+ 0.7 g/L，KH2PO4 3 g/L，30 ℃， pH 6.0搖瓶培養(yǎng)192 h，在此條件下漆酶的酶活提高了11.39倍，7 d內(nèi)該菌能使蘆葦木質(zhì)素降解23.63%。

關(guān)鍵詞：青霉菌；漆酶；產(chǎn)酶條件；木質(zhì)素降解

中圖分類號(hào)：TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2014）10-2379-04

Studies on Laccase from Penicillium and Its Application in Lignin Degradation

LU Qing-hua，XING Meng-lan，CAI Lu

（1. Institute of Bioengineering and Technology， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014010）

Abstract： The conditions of Penicillium for laccase production were optimized with single factor and orthogonal experiment. The degradation rates of the produced laccase for lignin from reed were determined. The results showed that the activity of laccase increased 11.39 times when Penicillium was cultured 192 h under 30℃ and pH of 6.0 with wheat bran of 17 g/L， yeast extract of 2 g/L， Al3+ of 0.7 g/L， KH2PO4 of 3 g/L. The lignin in reed could be degradated 23.63% in seven days by this Penicillium.

Key words： Penicillium； laccase； fermentation condition； lignin degradation

基金項(xiàng)目：教育部“春暉計(jì)劃”項(xiàng)目（Z200721201020）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目（NJzy08233）；內(nèi)蒙古包頭市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2008y100222）

漆酶（Laccase）由日本學(xué)者Yoshida[1]于1883年從漆樹(shù)中分離得到，其是一種很有潛力的含銅的多酚氧化酶，具有強(qiáng)大的催化能力[2-4]，被稱為“綠色催化劑”[5]。隨著生物造紙技術(shù)的日益成熟和研究的深入，漆酶在造紙工業(yè)上的研究和應(yīng)用也逐步深入，漆酶可以選擇性的降解木質(zhì)素，避免損傷纖維素和半纖維素。漆酶的高產(chǎn)菌株為白腐菌，白腐菌對(duì)木質(zhì)素具有很好的降解優(yōu)勢(shì)和降解選擇性，50 d時(shí)木質(zhì)素的降解率為33.9%～55.4%[6]。吳薇等[7]研究表明黃孢原毛平革菌和變色栓菌Sp1在24 d 時(shí)對(duì)麥草的木質(zhì)素降解率達(dá)到30%～65%。由于白腐菌特有的降解木質(zhì)素的功能，在生物制漿、生物漂白、廢水處理等的應(yīng)用都得到了重視[8]。但是，由于菌種產(chǎn)酶較低，降解周期長(zhǎng)，很難用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，今后研究的主要手段是篩選降解效果好、生長(zhǎng)周期短的菌種，并通過(guò)對(duì)產(chǎn)漆酶菌發(fā)酵條件的優(yōu)化來(lái)提高漆酶的活性和產(chǎn)量。

本研究通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)方法，對(duì)篩選的具有較高漆酶產(chǎn)量的青霉菌株進(jìn)行了培養(yǎng)條件的優(yōu)化， 同時(shí)探索了該漆酶在木質(zhì)素降解方面的性質(zhì)。

1材料與方法

1.1菌種

由實(shí)驗(yàn)室篩選得到，初步鑒定為青霉菌，命名為QM-001。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基： 馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨5 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然，1×105 Pa滅菌30 min。

1.2.2基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨5 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然，1×105 Pa滅菌30 min。

1.3方法

1.3.1產(chǎn)酶培養(yǎng)500 mL 的三角瓶裝200 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接種量為5%， 30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，測(cè)定酶活。漆酶活性測(cè)定以ABTS為底物，參照Galliano等[9]、Sonia等[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2單因素試驗(yàn)①不同碳源對(duì)QM-001產(chǎn)漆酶的影響。以蛋白胨為氮源，分別采用等量的不同碳源（乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥麩） 代替葡萄糖， 接種振蕩培養(yǎng)，在216 h時(shí)，測(cè)定其漆酶活力，確定最佳碳源。將得到的最佳碳源分別取15、16、17、18、19、20、21、22 g/L振蕩培養(yǎng)，216 h時(shí)，測(cè)定其產(chǎn)酶情況，得出其最佳濃度。②不同氮源對(duì)QM-001產(chǎn)漆酶影響。以麥麩為碳源，分別用等量的牛肉膏、酵母膏、尿素、硫酸銨代替蛋白胨進(jìn)行培養(yǎng)，在216 h時(shí)，測(cè)定其酶活，確定最佳氮源。其條件不變，將最佳氮源分別取1、2、3、4、5、6、7 g/L振蕩培養(yǎng)，216 h時(shí)測(cè)定其酶活，找到最佳濃度。③金屬離子對(duì)產(chǎn)漆酶的影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加相同濃度的金屬離子，170 r/min、30 ℃搖瓶培養(yǎng)7 d，測(cè)定不同金屬離子對(duì)QM-001產(chǎn)漆酶的影響。④初始pH和溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響。分別將基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始 pH調(diào)至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在170 r/min、30 ℃搖瓶培養(yǎng)216 h，測(cè)其酶活。在溫度為10、20、30、40、50 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)， 確定最佳發(fā)酵溫度。

1.3.3正交試驗(yàn)選擇麥麩、酵母膏、鋁離子和pH 4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.4青霉菌降解蘆葦木質(zhì)素在以上培養(yǎng)基中接入菌種，并加入長(zhǎng)為2～3 cm的蘆葦，做3個(gè)平行，置于恒溫振蕩器中30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d。以同等體積的蒸餾水和培養(yǎng)基以及另外降解木質(zhì)素的兩種細(xì)菌為對(duì)照分別浸泡相同質(zhì)量的蘆葦。7 d后分別測(cè)定各瓶中蘆葦?shù)哪举|(zhì)素含量。木質(zhì)素含量的測(cè)定采用GB/T 747-2003紙漿酸不溶木質(zhì)素的測(cè)定，GB/T 7978-2005紙漿酸不溶灰分的測(cè)定和GB/T 2677.2-2011造紙?jiān)纤值臏y(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)酶條件優(yōu)化的結(jié)果

2.1.1碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖1可知，當(dāng)采用麥麩為碳源時(shí)，明顯較其他碳源所產(chǎn)酶活力高。不同濃度的麥麩對(duì)產(chǎn)酶也有較大的影響，麥麩濃度在16g/L 時(shí)QM-001產(chǎn)漆酶酶活最大（圖2）。

2.1.2不同氮源對(duì)QM-001產(chǎn)漆酶影響由圖3可知，與有機(jī)氮源相比，無(wú)機(jī)氮源均不利于菌體產(chǎn)酶，可以看出酵母膏的作用最為顯著；牛肉膏次之；尿素的效果最差。因此選用酵母膏作為最佳氮源。由圖4可知，當(dāng)酵母膏濃度為3 g/L時(shí)，漆酶酶活達(dá)到最高。

2.1.3金屬離子對(duì)產(chǎn)漆酶的影響 由圖5可知，Al3+可明顯促進(jìn)其漆酶的增加，而Cu2+、Fe3+、Zn2+也能微弱地促進(jìn)漆酶的產(chǎn)生，但促進(jìn)程度依次降低；Mn2+效果不明顯，因此確定Al3+為最佳金屬離子。當(dāng)Al3+的濃度達(dá)到0.6 g/L時(shí)，QM-001產(chǎn)漆酶活力達(dá)到最高（圖6）。

2.1.4發(fā)酵pH和溫度對(duì)產(chǎn)漆酶的影響如圖7 所示，初始 pH 為 6.0 時(shí)所產(chǎn)漆酶酶活較高。由圖 8可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)， 所產(chǎn)漆酶活力明顯高于其他溫度下所產(chǎn)酶活力。

2.1.5正交試驗(yàn)由表2可知，4種因素對(duì)漆酶產(chǎn)量影響的主次順序?yàn)镈>B>A>C，B、D為影響漆酶產(chǎn)量的主要因素，pH對(duì)漆酶產(chǎn)量的影響最大，其次是酵母膏對(duì)漆酶產(chǎn)量的影響，可以看出 A3B1C3D2為最優(yōu)組合，即麥麩最佳濃度為17 g/L，酵母膏最佳濃度為 2 g/L，Al3+最佳濃度為 0.7 g/L，pH為6.0。此時(shí)酶活最高，為55.000 U/mL。

2.2優(yōu)化前后青霉菌產(chǎn)漆酶的比較

用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，獲得產(chǎn)酶曲線， 并與優(yōu)化前的產(chǎn)酶情況相比較， 結(jié)果如圖9 所示， 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化后， 青霉菌的產(chǎn)酶量顯著提升， 在192 h時(shí)有最大酶活， 約59.6 U/mL， 比優(yōu)化前的最大酶活4.81 U/mL 提高了11.39倍， 最高產(chǎn)酶時(shí)間提前了1 d。

2.3與其他菌種降解蘆葦木質(zhì)素的比較

從表3可知，蒸餾水組可近似為蘆葦木質(zhì)素的含量，培養(yǎng)基對(duì)蘆葦木質(zhì)素有一定的降解效果，但降解能力很低，只有 1.69%，可視為對(duì)木質(zhì)素降解無(wú)影響。青霉菌QM-001浸泡的蘆葦木質(zhì)素含量為25.30，降解率為23.63%。其他2種菌的木質(zhì)素含量分別為25.73和27.22，都比QM-001要高一些。這說(shuō)明該菌對(duì)紙漿造紙有一定的研究?jī)r(jià)值，雖然木質(zhì)素的降解是3種酶共同作用的結(jié)果，但是漆酶在其中起了很關(guān)鍵的作用，所以漆酶成了人們研究的重點(diǎn)[11]。

3結(jié)論

本研究以提高漆酶產(chǎn)量為目的，對(duì)所篩選的青霉菌的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化， 最佳培養(yǎng)條件為： 即麥麩最佳濃度為17 g/L，酵母膏最佳濃度為 2 g/L，Al3+最佳濃度為 0.7g/L，KH2PO43 g/L，160 r/min 搖瓶培養(yǎng)192 h 酶活性達(dá)59.6 U/mL， 較優(yōu)化前提高了11.39倍。在進(jìn)行生物紙漿的應(yīng)用時(shí)可以在常溫下使用，具有低耗能的優(yōu)點(diǎn)。

同時(shí)，本研究對(duì)菌種降解蘆葦木質(zhì)素進(jìn)行了考察，該酶能使蘆葦木質(zhì)素降解23.63%，雖然該菌酶活較低，但是生長(zhǎng)溫度低，周期較短，對(duì)未進(jìn)行預(yù)處理的蘆葦能在短時(shí)間內(nèi)降解，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室分離得到的菌種QM-001在生物紙漿過(guò)程中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，也為本實(shí)驗(yàn)室以后對(duì)制漿造紙的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] YOSHIDA H.Chemistry of lacquer[J]. Chem Soc，1883（43）：472-486.

[2] 劉家揚(yáng)，蔡宇杰.漆酶高產(chǎn)菌的篩選及產(chǎn)酶優(yōu)化[J].食品與科技，2010，26（4）：10-14.

[3]劉娜.漆酶改善纖維特性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2008，23（1）：95-100.

[4] 季立才，胡培植.漆酶催化氧化反應(yīng)研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1997，17（1）：79-84.

[5] 涂楚橋，梁宏，王光輝.Ag+離子對(duì)漆樹(shù)漆酶催化活性的抑制作用[J].廣西科學(xué)，1999，6（2）：109-110.

[6] 王宏勛，杜甫佑，張曉昱.白腐菌選擇性降解秸稈木質(zhì)纖維素研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（3）：97-100.

[7] 吳薇，頓寶慶，姜訓(xùn)鵬，等.高效木質(zhì)素降解菌的分離篩選[J].食品科技，2008（3）：22-25.

[8] 江凌，韋超海，梁世中.白腐菌降解木質(zhì)素酶系的特征及其應(yīng)用[J].化工進(jìn)展，2007，26（2）：198-202.

[9] GALLIANO H， GAS G， SERIS J L. Lignin degradation by Rigidoporus Lignosus involves synergistic action of two enzyme： MnP and Laccase[J]. Enzyme Microb Technol， 1991， 13：478-482.

[10] SONIA B Y，ZOUHAIER B，SAMI S. Catalytic behavior and detoxifying ability of an atypical homotrimeric laccase from the thermophilic strain Scytalidium thermophilum on selected azo and triarylmethane dyes[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2012，79：41-48.

[11] 徐海娟，梁文芷.白腐菌降解木素酶系及其作用原理[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2000，1（3）：51-54.

（責(zé)任編輯程碧軍）

1.3.3正交試驗(yàn)選擇麥麩、酵母膏、鋁離子和pH 4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.4青霉菌降解蘆葦木質(zhì)素在以上培養(yǎng)基中接入菌種，并加入長(zhǎng)為2～3 cm的蘆葦，做3個(gè)平行，置于恒溫振蕩器中30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d。以同等體積的蒸餾水和培養(yǎng)基以及另外降解木質(zhì)素的兩種細(xì)菌為對(duì)照分別浸泡相同質(zhì)量的蘆葦。7 d后分別測(cè)定各瓶中蘆葦?shù)哪举|(zhì)素含量。木質(zhì)素含量的測(cè)定采用GB/T 747-2003紙漿酸不溶木質(zhì)素的測(cè)定，GB/T 7978-2005紙漿酸不溶灰分的測(cè)定和GB/T 2677.2-2011造紙?jiān)纤值臏y(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)酶條件優(yōu)化的結(jié)果

2.1.1碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖1可知，當(dāng)采用麥麩為碳源時(shí)，明顯較其他碳源所產(chǎn)酶活力高。不同濃度的麥麩對(duì)產(chǎn)酶也有較大的影響，麥麩濃度在16g/L 時(shí)QM-001產(chǎn)漆酶酶活最大（圖2）。

2.1.2不同氮源對(duì)QM-001產(chǎn)漆酶影響由圖3可知，與有機(jī)氮源相比，無(wú)機(jī)氮源均不利于菌體產(chǎn)酶，可以看出酵母膏的作用最為顯著；牛肉膏次之；尿素的效果最差。因此選用酵母膏作為最佳氮源。由圖4可知，當(dāng)酵母膏濃度為3 g/L時(shí)，漆酶酶活達(dá)到最高。

2.1.3金屬離子對(duì)產(chǎn)漆酶的影響 由圖5可知，Al3+可明顯促進(jìn)其漆酶的增加，而Cu2+、Fe3+、Zn2+也能微弱地促進(jìn)漆酶的產(chǎn)生，但促進(jìn)程度依次降低；Mn2+效果不明顯，因此確定Al3+為最佳金屬離子。當(dāng)Al3+的濃度達(dá)到0.6 g/L時(shí)，QM-001產(chǎn)漆酶活力達(dá)到最高（圖6）。

2.1.4發(fā)酵pH和溫度對(duì)產(chǎn)漆酶的影響如圖7 所示，初始 pH 為 6.0 時(shí)所產(chǎn)漆酶酶活較高。由圖 8可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)， 所產(chǎn)漆酶活力明顯高于其他溫度下所產(chǎn)酶活力。

2.1.5正交試驗(yàn)由表2可知，4種因素對(duì)漆酶產(chǎn)量影響的主次順序?yàn)镈>B>A>C，B、D為影響漆酶產(chǎn)量的主要因素，pH對(duì)漆酶產(chǎn)量的影響最大，其次是酵母膏對(duì)漆酶產(chǎn)量的影響，可以看出 A3B1C3D2為最優(yōu)組合，即麥麩最佳濃度為17 g/L，酵母膏最佳濃度為 2 g/L，Al3+最佳濃度為 0.7 g/L，pH為6.0。此時(shí)酶活最高，為55.000 U/mL。

2.2優(yōu)化前后青霉菌產(chǎn)漆酶的比較

用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，獲得產(chǎn)酶曲線， 并與優(yōu)化前的產(chǎn)酶情況相比較， 結(jié)果如圖9 所示， 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化后， 青霉菌的產(chǎn)酶量顯著提升， 在192 h時(shí)有最大酶活， 約59.6 U/mL， 比優(yōu)化前的最大酶活4.81 U/mL 提高了11.39倍， 最高產(chǎn)酶時(shí)間提前了1 d。

2.3與其他菌種降解蘆葦木質(zhì)素的比較

從表3可知，蒸餾水組可近似為蘆葦木質(zhì)素的含量，培養(yǎng)基對(duì)蘆葦木質(zhì)素有一定的降解效果，但降解能力很低，只有 1.69%，可視為對(duì)木質(zhì)素降解無(wú)影響。青霉菌QM-001浸泡的蘆葦木質(zhì)素含量為25.30，降解率為23.63%。其他2種菌的木質(zhì)素含量分別為25.73和27.22，都比QM-001要高一些。這說(shuō)明該菌對(duì)紙漿造紙有一定的研究?jī)r(jià)值，雖然木質(zhì)素的降解是3種酶共同作用的結(jié)果，但是漆酶在其中起了很關(guān)鍵的作用，所以漆酶成了人們研究的重點(diǎn)[11]。

3結(jié)論

本研究以提高漆酶產(chǎn)量為目的，對(duì)所篩選的青霉菌的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化， 最佳培養(yǎng)條件為： 即麥麩最佳濃度為17 g/L，酵母膏最佳濃度為 2 g/L，Al3+最佳濃度為 0.7g/L，KH2PO43 g/L，160 r/min 搖瓶培養(yǎng)192 h 酶活性達(dá)59.6 U/mL， 較優(yōu)化前提高了11.39倍。在進(jìn)行生物紙漿的應(yīng)用時(shí)可以在常溫下使用，具有低耗能的優(yōu)點(diǎn)。

同時(shí)，本研究對(duì)菌種降解蘆葦木質(zhì)素進(jìn)行了考察，該酶能使蘆葦木質(zhì)素降解23.63%，雖然該菌酶活較低，但是生長(zhǎng)溫度低，周期較短，對(duì)未進(jìn)行預(yù)處理的蘆葦能在短時(shí)間內(nèi)降解，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室分離得到的菌種QM-001在生物紙漿過(guò)程中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，也為本實(shí)驗(yàn)室以后對(duì)制漿造紙的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] YOSHIDA H.Chemistry of lacquer[J]. Chem Soc，1883（43）：472-486.

[2] 劉家揚(yáng)，蔡宇杰.漆酶高產(chǎn)菌的篩選及產(chǎn)酶優(yōu)化[J].食品與科技，2010，26（4）：10-14.

[3]劉娜.漆酶改善纖維特性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2008，23（1）：95-100.

[4] 季立才，胡培植.漆酶催化氧化反應(yīng)研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1997，17（1）：79-84.

[5] 涂楚橋，梁宏，王光輝.Ag+離子對(duì)漆樹(shù)漆酶催化活性的抑制作用[J].廣西科學(xué)，1999，6（2）：109-110.

[6] 王宏勛，杜甫佑，張曉昱.白腐菌選擇性降解秸稈木質(zhì)纖維素研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（3）：97-100.

[7] 吳薇，頓寶慶，姜訓(xùn)鵬，等.高效木質(zhì)素降解菌的分離篩選[J].食品科技，2008（3）：22-25.

[8] 江凌，韋超海，梁世中.白腐菌降解木質(zhì)素酶系的特征及其應(yīng)用[J].化工進(jìn)展，2007，26（2）：198-202.

[9] GALLIANO H， GAS G， SERIS J L. Lignin degradation by Rigidoporus Lignosus involves synergistic action of two enzyme： MnP and Laccase[J]. Enzyme Microb Technol， 1991， 13：478-482.

[10] SONIA B Y，ZOUHAIER B，SAMI S. Catalytic behavior and detoxifying ability of an atypical homotrimeric laccase from the thermophilic strain Scytalidium thermophilum on selected azo and triarylmethane dyes[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2012，79：41-48.

[11] 徐海娟，梁文芷.白腐菌降解木素酶系及其作用原理[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2000，1（3）：51-54.

（責(zé)任編輯程碧軍）

1.3.3正交試驗(yàn)選擇麥麩、酵母膏、鋁離子和pH 4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.4青霉菌降解蘆葦木質(zhì)素在以上培養(yǎng)基中接入菌種，并加入長(zhǎng)為2～3 cm的蘆葦，做3個(gè)平行，置于恒溫振蕩器中30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d。以同等體積的蒸餾水和培養(yǎng)基以及另外降解木質(zhì)素的兩種細(xì)菌為對(duì)照分別浸泡相同質(zhì)量的蘆葦。7 d后分別測(cè)定各瓶中蘆葦?shù)哪举|(zhì)素含量。木質(zhì)素含量的測(cè)定采用GB/T 747-2003紙漿酸不溶木質(zhì)素的測(cè)定，GB/T 7978-2005紙漿酸不溶灰分的測(cè)定和GB/T 2677.2-2011造紙?jiān)纤值臏y(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)酶條件優(yōu)化的結(jié)果

2.1.1碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖1可知，當(dāng)采用麥麩為碳源時(shí)，明顯較其他碳源所產(chǎn)酶活力高。不同濃度的麥麩對(duì)產(chǎn)酶也有較大的影響，麥麩濃度在16g/L 時(shí)QM-001產(chǎn)漆酶酶活最大（圖2）。

2.1.2不同氮源對(duì)QM-001產(chǎn)漆酶影響由圖3可知，與有機(jī)氮源相比，無(wú)機(jī)氮源均不利于菌體產(chǎn)酶，可以看出酵母膏的作用最為顯著；牛肉膏次之；尿素的效果最差。因此選用酵母膏作為最佳氮源。由圖4可知，當(dāng)酵母膏濃度為3 g/L時(shí)，漆酶酶活達(dá)到最高。

2.1.3金屬離子對(duì)產(chǎn)漆酶的影響 由圖5可知，Al3+可明顯促進(jìn)其漆酶的增加，而Cu2+、Fe3+、Zn2+也能微弱地促進(jìn)漆酶的產(chǎn)生，但促進(jìn)程度依次降低；Mn2+效果不明顯，因此確定Al3+為最佳金屬離子。當(dāng)Al3+的濃度達(dá)到0.6 g/L時(shí)，QM-001產(chǎn)漆酶活力達(dá)到最高（圖6）。

2.1.4發(fā)酵pH和溫度對(duì)產(chǎn)漆酶的影響如圖7 所示，初始 pH 為 6.0 時(shí)所產(chǎn)漆酶酶活較高。由圖 8可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)， 所產(chǎn)漆酶活力明顯高于其他溫度下所產(chǎn)酶活力。

2.1.5正交試驗(yàn)由表2可知，4種因素對(duì)漆酶產(chǎn)量影響的主次順序?yàn)镈>B>A>C，B、D為影響漆酶產(chǎn)量的主要因素，pH對(duì)漆酶產(chǎn)量的影響最大，其次是酵母膏對(duì)漆酶產(chǎn)量的影響，可以看出 A3B1C3D2為最優(yōu)組合，即麥麩最佳濃度為17 g/L，酵母膏最佳濃度為 2 g/L，Al3+最佳濃度為 0.7 g/L，pH為6.0。此時(shí)酶活最高，為55.000 U/mL。

2.2優(yōu)化前后青霉菌產(chǎn)漆酶的比較

用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，獲得產(chǎn)酶曲線， 并與優(yōu)化前的產(chǎn)酶情況相比較， 結(jié)果如圖9 所示， 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化后， 青霉菌的產(chǎn)酶量顯著提升， 在192 h時(shí)有最大酶活， 約59.6 U/mL， 比優(yōu)化前的最大酶活4.81 U/mL 提高了11.39倍， 最高產(chǎn)酶時(shí)間提前了1 d。

2.3與其他菌種降解蘆葦木質(zhì)素的比較

從表3可知，蒸餾水組可近似為蘆葦木質(zhì)素的含量，培養(yǎng)基對(duì)蘆葦木質(zhì)素有一定的降解效果，但降解能力很低，只有 1.69%，可視為對(duì)木質(zhì)素降解無(wú)影響。青霉菌QM-001浸泡的蘆葦木質(zhì)素含量為25.30，降解率為23.63%。其他2種菌的木質(zhì)素含量分別為25.73和27.22，都比QM-001要高一些。這說(shuō)明該菌對(duì)紙漿造紙有一定的研究?jī)r(jià)值，雖然木質(zhì)素的降解是3種酶共同作用的結(jié)果，但是漆酶在其中起了很關(guān)鍵的作用，所以漆酶成了人們研究的重點(diǎn)[11]。

3結(jié)論

本研究以提高漆酶產(chǎn)量為目的，對(duì)所篩選的青霉菌的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化， 最佳培養(yǎng)條件為： 即麥麩最佳濃度為17 g/L，酵母膏最佳濃度為 2 g/L，Al3+最佳濃度為 0.7g/L，KH2PO43 g/L，160 r/min 搖瓶培養(yǎng)192 h 酶活性達(dá)59.6 U/mL， 較優(yōu)化前提高了11.39倍。在進(jìn)行生物紙漿的應(yīng)用時(shí)可以在常溫下使用，具有低耗能的優(yōu)點(diǎn)。

同時(shí)，本研究對(duì)菌種降解蘆葦木質(zhì)素進(jìn)行了考察，該酶能使蘆葦木質(zhì)素降解23.63%，雖然該菌酶活較低，但是生長(zhǎng)溫度低，周期較短，對(duì)未進(jìn)行預(yù)處理的蘆葦能在短時(shí)間內(nèi)降解，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室分離得到的菌種QM-001在生物紙漿過(guò)程中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，也為本實(shí)驗(yàn)室以后對(duì)制漿造紙的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] YOSHIDA H.Chemistry of lacquer[J]. Chem Soc，1883（43）：472-486.

[2] 劉家揚(yáng)，蔡宇杰.漆酶高產(chǎn)菌的篩選及產(chǎn)酶優(yōu)化[J].食品與科技，2010，26（4）：10-14.

[3]劉娜.漆酶改善纖維特性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2008，23（1）：95-100.

[4] 季立才，胡培植.漆酶催化氧化反應(yīng)研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1997，17（1）：79-84.

[5] 涂楚橋，梁宏，王光輝.Ag+離子對(duì)漆樹(shù)漆酶催化活性的抑制作用[J].廣西科學(xué)，1999，6（2）：109-110.

[6] 王宏勛，杜甫佑，張曉昱.白腐菌選擇性降解秸稈木質(zhì)纖維素研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（3）：97-100.

[7] 吳薇，頓寶慶，姜訓(xùn)鵬，等.高效木質(zhì)素降解菌的分離篩選[J].食品科技，2008（3）：22-25.

[8] 江凌，韋超海，梁世中.白腐菌降解木質(zhì)素酶系的特征及其應(yīng)用[J].化工進(jìn)展，2007，26（2）：198-202.

[9] GALLIANO H， GAS G， SERIS J L. Lignin degradation by Rigidoporus Lignosus involves synergistic action of two enzyme： MnP and Laccase[J]. Enzyme Microb Technol， 1991， 13：478-482.

[10] SONIA B Y，ZOUHAIER B，SAMI S. Catalytic behavior and detoxifying ability of an atypical homotrimeric laccase from the thermophilic strain Scytalidium thermophilum on selected azo and triarylmethane dyes[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2012，79：41-48.

[11] 徐海娟，梁文芷.白腐菌降解木素酶系及其作用原理[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2000，1（3）：51-54.

（責(zé)任編輯程碧軍）