劉佳卉 秦緒偉 趙 遠(yuǎn) 張澤林 （齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東 濟(jì)南 250100）

綠膿桿菌，是引起水貂出血性肺炎的主要病原菌。該病多發(fā)于溫暖潮濕的夏秋兩季，最適宜生長(zhǎng)溫度為30～37℃，可感染眾多哺乳動(dòng)物、禽類(lèi)、爬行類(lèi)和魚(yú)類(lèi)[1]，發(fā)病急，死亡快，水貂死亡肺部呈現(xiàn)出嚴(yán)重的病理變化。此病的死亡率非常高，目前已成為嚴(yán)重阻礙我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的烈性傳染病之一，本研究從臨床病死水貂中分離鑒定得到一株綠膿桿菌，并對(duì)其進(jìn)行了耐藥性分析，為地區(qū)性水貂出血性肺炎的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 采集來(lái)自山東諸城某一水貂養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)的水貂出血性肺炎的水貂，水貂換毛期間，口鼻流血死亡，血清平板細(xì)菌分離獲得菌株。

1.2 陽(yáng)性血清和其他材料 G型、B型、C型綠膿桿菌陽(yáng)性血清購(gòu)自日本力生研株式會(huì)社；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；微量生化試劑管購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑公司。

1.3 細(xì)菌分離純化 無(wú)菌條件下對(duì)病死水貂肺臟劃線，接種于血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落后挑取菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.4 分離菌的生化鑒定 參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 7918.4-87《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》，對(duì)分離純化的疑似菌株進(jìn)行生化鑒定，包括十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)試驗(yàn)、染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)。

1.5 分離菌的分子生物學(xué)鑒定 參考文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。上游：5’-ACGGGTGAG TAATGCC-3’，下游：5’-CAGTCTCCTTAGAGT GCC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1051bp。PCR采用25μl體系，取1.5μl樣品作為模板，加入10×Ex Taq Buffer2.5μl，上、下游引物各0.2μl，dNTP2μl、最后加Ex Taq酶0.2μl，用滅菌純水補(bǔ)足到25μl。擴(kuò)增條件為：94℃4min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，30次循環(huán)；72℃10min。

1.6 分離菌的血清型鑒定 分別取綠膿桿菌陽(yáng)性血清G型、B型、C型一滴，滴于載玻片上，用接種環(huán)取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落與血清混合，1min過(guò)后觀察有無(wú)凝集。

1.7 分離菌的藥敏試驗(yàn) 從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，均勻密集劃線接種于血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按K-B紙片法測(cè)定該菌其對(duì)常用抗菌藥物的敏感性。

1.8 分離菌的毒力試驗(yàn) 從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細(xì)菌計(jì)數(shù)，100倍稀釋腹腔注射16～20g小白鼠3只，0.3ml/只，對(duì)照注射生理鹽水2只，觀察7d。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離和培養(yǎng)特性結(jié)果 分離的細(xì)菌在血清肉湯培養(yǎng)基上形成圓形，光滑，稍隆起，邊緣整齊或者波浪狀的綠色菌落，并有獨(dú)特的芳香氣味(圖1A)。革蘭氏染色鏡檢，為革蘭氏陰性小桿菌，單個(gè)散在或成對(duì)出現(xiàn)(圖1B)，在SS瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基呈現(xiàn)典型性褐色菌落，菌落不規(guī)則，邊緣呈現(xiàn)傘狀伸展[2]，在綠膿菌素培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色。2.2 分離菌的生化鑒定結(jié)果 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。分離株氧化酶試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)、明膠液化、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)和42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)三者均為陽(yáng)性，符合綠膿桿菌生化特性。

圖1 分離株形態(tài)學(xué)觀察

表1 分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分離菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 經(jīng)過(guò)綠膿桿菌PCR檢測(cè)，該菌株在1051bp左右處產(chǎn)生目的條帶，確定為綠膿桿菌菌株(圖2)。

圖2 綠膿桿菌PCR鑒定結(jié)果

2.4 分離菌血清型的鑒定結(jié)果 分別取綠膿桿菌陽(yáng)性血清G型、B型、C型一滴，滴于載玻片上，用接種環(huán)取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落與血清混合，1min過(guò)后觀察可見(jiàn)C型血清呈現(xiàn)均勻的顆粒狀凝集，B型、G型血清未見(jiàn)凝集。

2.5 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)對(duì)抑菌圈的大小進(jìn)行測(cè)量比對(duì)，結(jié)果表明該細(xì)菌對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦、丁胺卡那霉素、慶大霉素高度敏感，對(duì)頭孢曲松、恩諾沙星、鏈霉素、多粘菌素B中度敏感，對(duì)阿莫西林、林可霉素、復(fù)方新諾明耐藥(表2)。

表2 分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑) (mm)

2.6 分離菌的毒力試驗(yàn)結(jié)果 分離菌液體培養(yǎng)24h，細(xì)菌計(jì)數(shù)70億/ml，注射36h～48h試驗(yàn)組小白鼠被毛凌亂，消瘦，死亡，對(duì)照組觀察7日正常。分離菌對(duì)小白鼠毒力較強(qiáng)。

3 討論

在臨床出血性肺炎的細(xì)菌分離中，綠膿桿菌以B型、G型居多[3]，C型綠膿桿菌分離比較少，本試驗(yàn)從患有出血性肺炎的病死水貂肺臟中分離致病菌，經(jīng)過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化實(shí)驗(yàn)、PCR鑒定、血清凝集試驗(yàn)，最終確定為致病性C型綠膿桿菌。

不同地區(qū)分離的綠膿桿菌會(huì)因?yàn)檠逍偷牟煌蛘弋?dāng)?shù)氐挠盟幥闆r不同而對(duì)抗生素的耐藥性產(chǎn)生差異，因此在養(yǎng)殖場(chǎng)不要單一長(zhǎng)時(shí)間用藥，要根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的藥物進(jìn)行治療，或者輪換用藥。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可以選擇左氧氟沙星全群拌料，慶大霉素、頭孢哌酮-舒巴坦或丁胺卡那霉素注射作為治療方案，經(jīng)過(guò)全場(chǎng)消毒、飼料熟制、藥物治療，第3天死亡下降，第5天停止死亡，第7天食欲全部恢復(fù)正常，達(dá)到了良好的治療效果。另外也可以選擇綠膿桿菌疫苗進(jìn)行免疫，單一血清型綠膿桿菌疫苗保護(hù)性較差，應(yīng)采取多價(jià)菌株疫苗進(jìn)行預(yù)防[4]，有時(shí)候使用了疫苗還會(huì)發(fā)病，主要是因?yàn)檠逍筒煌鸬?，此外發(fā)生出血性肺炎除了綠膿桿菌的各個(gè)血清型之外還有克雷伯氏菌、巴氏桿菌、肺炎雙球菌等，一旦發(fā)生疾病還需要進(jìn)行細(xì)菌分離和藥敏試驗(yàn)，以確定疾病的類(lèi)型和給予正確的治療治療方案，減少損失。

近幾年來(lái)，我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較快，養(yǎng)殖數(shù)量及密度不斷提高，但是環(huán)境管理和疾病控制卻相對(duì)滯后。水貂在免疫力低下的情況下很容易感染一些條件致病菌，因此控制該類(lèi)疾病除確定病原、接種疫苗、篩選敏感藥物外，還需要提高水貂養(yǎng)殖環(huán)境，注重飼料的合理搭配，提高水貂免疫力，從而控制原發(fā)疾病，形成科學(xué)規(guī)范的飼養(yǎng)管理，達(dá)到良好的經(jīng)濟(jì)效益。

[1]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)第5版[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2013, 152-153.

[2]周庭銀.臨床微生物學(xué)診斷與圖解第2版[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.2006, 197-200.

[3]白雪等.水貂綠膿桿菌分離株的生物學(xué)特性和血清型分析[J].畜牧與獸醫(yī), 2011(7): 31-35.

[4]柴秀麗等.水貂出血性肺炎的防治[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物, 2008(6): 13.