張曉瑞，鄒桂欣，李國信，尤獻(xiàn)民*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

研究開發(fā)

射干藥材固體發(fā)酵前后6種異黃酮成分含量變化△

張曉瑞1，鄒桂欣2，李國信2，尤獻(xiàn)民2*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽110847；2.遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽110034)

目的：研究射干藥材經(jīng)枯草芽孢桿菌和黑曲霉發(fā)酵后其中6種異黃酮成分含量的變化。方法：利用HPLC檢測經(jīng)黑曲霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵20d時射干藥材中6種異黃酮成分的含量，并與發(fā)酵前比較，計算各成分的含量變化。結(jié)果：經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵能增加鳶尾黃素和次野鳶尾黃素的含量，經(jīng)黑曲霉發(fā)酵能增加次野鳶尾黃素的含量。結(jié)論：利用枯草芽孢桿菌和黑曲霉發(fā)酵后，可使射干藥材中苷元成分增加。

射干；枯草芽孢桿菌；黑曲霉菌；固體發(fā)酵

射干(Belamcandae Rhizoma)為鳶尾科植物射干Belamcandachinensis(L.)DC.的干燥根莖，含有的異黃酮類成分苷及苷元具有抗炎、止咳等功效[1]，因此提高射干藥材中異黃酮苷及苷元的含量也是增加射干藥效作用的途徑之一。固體發(fā)酵是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶使底物進(jìn)行有機(jī)反應(yīng)[2]，在中藥中已有廣泛的應(yīng)用，可以將中藥的無效成分轉(zhuǎn)化為有效成分[3]，提高中藥的藥效[4]，減弱中藥的毒副作用[5]，促進(jìn)中藥活性成分吸收[6]，為中藥組分代謝機(jī)制研究提供輔助手段[7]，降低中藥的生產(chǎn)成本[8]。目前固體發(fā)酵中，黑曲霉和枯草芽孢桿菌得到越來越廣泛的應(yīng)用[9-10]，本文采用固體發(fā)酵方法處理射干藥材，探討黑曲霉和枯草芽孢桿菌對射干異黃酮成分的影響，比較射干藥材經(jīng)上述兩種微生物固體發(fā)酵轉(zhuǎn)化前后的6種有效成分含量變化，為使射干藥材得到更有效利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器

Aglient1100液相色譜儀(美國Aglient科技公司)，色譜工作站(AgilentChemstation工作站)，F(xiàn)A1004光電分析天平(上海天平儀器廠)，色譜柱：ThenomenexSynergiTolar-RP80A(250mm×4.6mm，4μm)。

1.2材料

乙腈為色譜純，甲醇、磷酸為分析純，娃哈哈純凈水。

射干苷、次野鳶尾黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111632-200501，111557-200602)；野鳶尾苷、野鳶尾黃素對照品(成都普瑞法科技有限公司，批號分別為13030803，13051402，純度均大于98%)；鳶尾黃素對照品(成都生物科技有限公司，批號：12081808)；白射干素對照品(自制，高效液相色譜法，純度大于98.5%)。射干購自河北安國，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)生藥室李峰教授鑒定為Belamcandachinensis(L.)DC的干燥根莖。實(shí)驗(yàn)菌種：枯草芽孢桿菌和黑曲霉(遼寧北方藥檢科技有限公司，批號分別為63501-2a12，201103)，麥麩(市售)。

2 方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)操作

精密稱量0.5g射干藥材粉末、0.5g麥麩，置于錐形瓶中二者混勻，加5mL水濕潤，平行3份，向樣品瓶分別接種1mL枯草芽孢桿菌及黑曲霉菌液，濃度分別為105，2×104CFU·mL-1，分別在30～35℃和25～28℃條件下發(fā)酵。

2.2射干異黃酮成分測定方法

2.2.1色譜條件ThenomenexSynergiTolar-RP80A色譜柱(250mm×4.6mm，4μm)，流動相A為0.2%磷酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～15min，A為85%～75%；15～25min，A為75%～72%；25～35min，A為72%～65%；35～50min，A為65%～50%。流速：1.0mL·min-1；檢測波長：265nm；進(jìn)樣量：20μL，柱溫：30℃，典型色譜圖見圖1。

圖1 射干藥材真菌發(fā)酵前后的HPLC圖A.混合對照品 B.黑曲霉菌發(fā)酵 C.枯草芽孢桿菌發(fā)酵 D.射干藥材 E.麥麩1.射干苷 2.野鳶尾苷 3.鳶尾黃素 4.野鳶尾黃素 5.次野鳶尾黃素 6.白射干素

2.2.2對照品溶液制備 精密稱取射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素及白射干素對照品各適量，置同一容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，制成含射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素及白射干素的混合對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.128，0.170，0.210，0.192，0.072，0.038mg·mL-1。

2.2.3供試品溶液制備 精密稱取射干粉末及麥麩各0.5g，置50mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，稱重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。

2.2.4線性關(guān)系的考察 分別精密吸取混合對照品溶液2，4，6，8，10μL，注入液相色譜儀中，測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表1，各成分線性關(guān)系良好。

表1 6種異黃酮類成分線性關(guān)系測定結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素及白射干素的RSD分別為0.25%，0.26%，0.24%，0.33%，0.28%，0.34%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于供試品溶液放置0，2，4，8，12 h時精密吸取20 μL，注入液相色譜儀中，測定，計算RSD，結(jié)果射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素及白射干素的RSD分別為0.61%，0.42%，2.2%，0.50%，0.42%，2.9%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取射干及麥麩各0.5 g，平行6份，按2.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，測定，射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素及白射干素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.47，2.9，1.6，2.3，0.79，0.50 mg·g-1，RSD分別為0.52%，0.48%，2.3%，0.51%，0.46%，2.6%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取射干粉末0.25 g及麥麩0.5 g，平行6份，分別精密加入混合對照品適量，按供試品溶液處理方法制備樣品，測定，進(jìn)樣20 μL，計算加樣回收率。射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素及白射干素的平均回收率分別為103.1%，101.5%，103.3%，99.8%，100.3%，99.1%，RSD分別為2.5%，2.8%，1.4%，1.1%，1.2%，2.7%，表明實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度良好。

2.3樣品測定

于發(fā)酵20d時取相應(yīng)組的藥材，分別精密加入70%乙醇25mL，超聲提取30min，濾過，精密吸取續(xù)濾液20μL，分別注入液相色譜儀中，按2.2.1色譜條件測定。

采用外標(biāo)法計算不同實(shí)驗(yàn)條件各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以空白組各組分含量為100%，計算各成分變化百分率，結(jié)果見圖2。

圖2 兩種真菌固體發(fā)酵20 d時射干中6種異黃酮成分的變化

2.4數(shù)據(jù)分析

由圖2可見，枯草芽孢桿菌發(fā)酵20d，射干苷、野鳶尾苷、野鳶尾黃素及白射干素的含量有不同程度的下降，但鳶尾黃素及野鳶尾黃素含量有所提高，尤其是鳶尾黃素含量增加了60%。

黑曲霉菌發(fā)酵20d，除次野鳶尾黃素含量有增加外，其余5種異黃酮成分均有大幅降低，鳶尾黃素和白射干素幾乎檢測不到，但能在異黃酮苷及苷元中檢測到多個未知成分。

3 討論

實(shí)驗(yàn)中曾經(jīng)對固體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)選，每個菌種選擇3個濃度，分別發(fā)酵10，20，30d，結(jié)果表明采用中等濃度的枯草芽孢桿菌發(fā)酵20d效果最好，可使具有多種藥理活性作用的鳶尾黃素及野鳶尾黃素含量顯著提高。

由圖1-B可見，在黑曲霉菌發(fā)酵中，雖然測定的6種異黃酮成分含量損失較大，但也在保留時間20～30min之間產(chǎn)生了一些新的色譜峰，這些新物質(zhì)的分離鑒定及藥效作用正在進(jìn)一步研究中。

射干藥材中的異黃酮成分，尤其是苷元具有抗炎、止咳等多種藥理作用，本文研究結(jié)果表明，固體發(fā)酵可以提高鳶尾黃素和次野鳶尾黃素等苷元的含量，為應(yīng)用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)提高射干藥材有效成分含量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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SixKindsofIsoflavoneConstituentofBelamcandaeRhizomaBeforeandAfterSolidFermentation

ZHANG Xiaorui1，ZOU Guixin2，LI Guoxin2，YOU Xianmin2*

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110847；China；2.Liaoning Province Institute of TCM，Shenyang110034，China)

Objective：To investigate six kinds of isoflavone constituent of Belamcandae Rhizoma after fermentation byBacillussubtilisandAspergillusniger.Methods：To compare with the content of six kinds of isoflavone before and after(20 days)fermented byB.subtilisandA.niger.The contents were determined by HPLC method.Results：The contents of tectorigenin and irisflorentin can be raised after ferment byB.subtilis，and irisflorentin can be raised after ferment byA.niger.Conclusion：The content of aglycone can be raised，after Belamcandae Rhizoma was fermented byB.subtilisandA.niger.

Belamcandae Rhizoma，Bacillussubtilis，Aspergillusniger，Solid fermentation.

“十二五”國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目——中藥新藥臨床評價研究技術(shù)平臺(2012zx09303-017)，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273927)，國家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科

*

尤獻(xiàn)民，研究員，研究方向：中藥質(zhì)量控制方法；Tel：(024)86803173，E-mail：youxianmin1120@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.003

2014-03-01)