姚譞，何樞衡，唐英

(1.國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海 201203；2.上海中藥制藥技術(shù)有限公司，上海 201203)

金錢草抗痛風(fēng)活性組分的提取分離及藥效篩選△

姚譞1，2*，何樞衡1，2，唐英1，2

(1.國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海 201203；2.上海中藥制藥技術(shù)有限公司，上海 201203)

目的：以藥效指標(biāo)及化學(xué)成分含量為導(dǎo)向，考察金錢草提取純化工藝路線，篩選金錢草抗痛風(fēng)活性組分，并對(duì)活性組分開展藥效學(xué)研究和化學(xué)成分分析。方法：建立高尿酸血癥小鼠模型，對(duì)金錢草的不同提取和純化組分進(jìn)行藥效篩選，以UV法測(cè)定各組分總黃酮含量，兩者相結(jié)合優(yōu)選金錢草提取純化工藝路線。從降尿酸活性和抗炎活性方面對(duì)活性組分開展藥效學(xué)研究，考察量效關(guān)系，并采用HPLC分析方法對(duì)其主要化學(xué)成分進(jìn)行研究。結(jié)果：最佳提取分離工藝為金錢草通過乙醇提取，以Diaion HP-20大孔樹脂為柱填料，用30%乙醇洗脫除雜，收集60%乙醇洗脫所得組分(LCA60)。經(jīng)藥效學(xué)研究LCA60可顯著降低高尿酸血癥小鼠模型血清尿酸含量，且具有明顯的抗炎活性，經(jīng)UV和HPLC分析，其總黃酮含量為67.0%，其中包括有山柰酚8.4%、槲皮素7.6%、蘆丁7.3%、表兒茶素9.1%、橙皮苷8.8%。結(jié)論：LCA60為篩選得到的金錢草抗痛風(fēng)活性組分。

金錢草；活性組分；痛風(fēng)；總黃酮

痛風(fēng)是長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起組織損傷的一組異質(zhì)性疾病，臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石沉積、特征性慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形，常累及腎臟，引起慢性間質(zhì)性腎炎和腎尿酸結(jié)石形成[1]。臨床常用非甾體抗炎藥和秋水仙堿治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，別嘌醇片降低血中尿酸濃度，丙璜舒和苯溴馬隆作為尿酸排泄劑，但這些藥物具有明顯的副作用，不適合長(zhǎng)期使用[2]。目前，從中草藥中尋找新型抗痛風(fēng)藥物成為熱點(diǎn)，民間及中醫(yī)臨床上常用金錢草單味或復(fù)方治療高尿酸血癥、痛風(fēng)，無明顯不良反應(yīng)[3]。筆者以高尿酸血癥小鼠模型的藥效指標(biāo)及主要活性組分含量為指導(dǎo)，開展提取分離金錢草中抗痛風(fēng)活性組分研究，為開發(fā)抗痛風(fēng)植物藥提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

昆明種小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，雄性，體重(28±2)g。使用前在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中自由飲水和供給食物。

1.2 試藥

金錢草(上海華宇藥業(yè)有限公司)；氧嗪酸鉀、別嘌呤醇(Sigma公司)；阿司匹林片(丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司)；山柰酚對(duì)照品(批號(hào)：110861-200606)、槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：100081-200406)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-200707)、表兒茶素對(duì)照品(批號(hào)：110878-200102)、橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：110721-200512)(中國食品藥品檢定研究院)；尿酸(URIC)試劑盒(Beckman公司)；Diaion HP-20大孔吸附樹脂(北京綠百草科技發(fā)展有限公司)。

1.3 儀器

BECKMAN COULTER AU480全自動(dòng)生化分析儀；Agilent 1260高效液相色譜儀。

2 方法

2.1 金錢草的提取分離

金錢草水提物(LCWE)：按照水提工藝制備，提取2次，每次提取1 h，第1次12倍水，第2次10倍水，過濾，合并兩次提取液，減壓、濃縮干燥至固體。

金錢草醇提物(LCAE)：按照醇提取工藝制備，提取2次，每次10倍70%乙醇加熱至60 ℃，回流提取1 h，過濾，合并兩次提取液，減壓、濃縮干燥至固體。

金錢草醇提物分離純化：取制備的金錢草醇提物，加水溶解，經(jīng)樹脂選型及篩選，選擇Diaion HP-20大孔吸附樹脂進(jìn)行層析，提取物樹脂質(zhì)量比為1∶20。依次用水及30%，60%，95%乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，每個(gè)梯度洗脫4～5個(gè)柱體積，每小時(shí)流速為2～3個(gè)柱體積。洗脫結(jié)束后30%乙醇部位(LCA30)、60%乙醇部位(LCA60)和95%乙醇部位(LCA95)分別濃縮干燥。

2.2 高尿酸血癥小鼠模型

昆明種小鼠按體重隨機(jī)平均分組，每組12只，設(shè)立空白對(duì)照組、高尿酸血癥模型組、別嘌呤醇陽性藥物組、金錢草各實(shí)驗(yàn)組。陽性藥物組灌胃給予別嘌呤醇，劑量為2.5 mg·kg-1，金錢草各實(shí)驗(yàn)組灌胃給予各樣品，其余各組給予蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。末次給藥前0.5 h腹腔注射氧嗪酸鉀，劑量為300 mg·kg-1，空白對(duì)照組腹腔注射0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，1.5 h后摘眼球采血，血樣采集后于室溫放置約1 h，待血液完全凝固后于3 500 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，取血清用生化分析儀檢測(cè)血清尿酸含量。

2.3 小鼠耳腫脹炎癥模型

用二甲苯致小鼠耳腫脹，建立小鼠耳腫脹炎癥模型。小鼠隨機(jī)分為金錢草各實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和阿司匹林陽性藥物組，每組12只。灌胃容積均為20 mL·kg-1，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后1 h，小鼠右耳均勻涂上25 μL二甲苯致炎，15 min后處死小鼠，剪下左、右兩耳，用直徑8 mm打孔器在同一部位沖下耳片，稱重，以左、右耳片重量差值表示炎性腫脹程度，腫脹度(g)=右耳片重量-左耳片重量，將其耳腫脹度進(jìn)行組間比較，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2.4 活性組分含量分析方法

2.4.1 總黃酮含量測(cè)定 以蘆丁為對(duì)照品，通過UV測(cè)定活性組分中的總黃酮類成分。分別吸取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.2 mg·kg-1)0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于6個(gè)25 mL容量瓶中，分別加入蒸餾水7.0，6.0，5.0，4.0，3.0，2.0 mL，搖勻；加入5%亞硝酸鈉1.0 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加蒸餾水至定容，搖勻，顯色15 min后，于510 nm波長(zhǎng)測(cè)其吸光度。用最小二乘法線性回歸，溶液吸光度(Y)與蘆丁質(zhì)量濃度(X)(mg·mL-1)的回歸方程為Y=5.175 8X+0.003 2，r=0.999 6。

按照上述方法測(cè)定待測(cè)溶液中總黃酮吸光度，由回歸方程即可求得總黃酮含量。

2.4.2 活性組分中的化學(xué)成分組成測(cè)定 應(yīng)用HPLC，色譜條件：Agilent 1260 DAD，色譜柱為AX-09柱；流動(dòng)相為乙腈-2%冰醋酸梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm；柱溫為30 ℃。精密稱量LCA60樣品26.1 mg置于25 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解后定容至刻度，過濾，即得。精密吸取樣品溶液5 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件分析。流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

3 結(jié)果

3.1 金錢草提取工藝篩選

金錢草在傳統(tǒng)使用以及中藥復(fù)方臨床上均采用水煎的方式服用[4-5]，而分析表明其化學(xué)成分主要是黃酮苷以及黃酮類成分，如蘆丁、槲皮素等非水溶性成分[6-8]，為提高金錢草提取工藝的科學(xué)性，以藥效指標(biāo)和有效成分含量為導(dǎo)向，對(duì)金錢草水提和醇提取兩種提取工藝路線進(jìn)行篩選和比較。

根據(jù)水提和醇提工藝，分別制備得到LCWE和LCAE，建立氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠模型[9]，比較研究2種提取物的降尿酸藥效作用，平行設(shè)空白對(duì)照組、模型組和陽性藥物組。表2結(jié)果表明，小鼠在腹腔注射氧嗪酸鉀后，與空白對(duì)照組相比，血清尿酸水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明建模成功。LCAE相比于LCWE具有更好的降尿酸藥效，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。含量測(cè)定結(jié)果表明，LCAE出膏率為8.3%，總黃酮以蘆丁計(jì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.7%，相比LCWE含量更高，出膏率更低。因此，基于藥效指標(biāo)和化學(xué)成分含量綜合考慮，金錢草醇提取相比于水提取，能夠更好地提取和富集其總黃酮部位，具有較低的出膏率，避免提取更多的雜質(zhì)成分，且藥效作用更優(yōu)，醇提取工藝為更優(yōu)的金錢草提取方法。

表2 金錢草水提物和醇提物出膏率、總黃酮含量及血清尿酸比較

注：與模型組比，**P<0.01；與空白對(duì)照組相比，△△P<0.01

3.2 金錢草抗痛風(fēng)中藥組分的分離純化和篩選

大孔吸附樹脂是中藥提取液精制、去除無效成分的一種分離純化工藝。前期考察了多個(gè)大孔吸附樹脂對(duì)金錢草醇提物的分離純化效果，篩選得到Diaion HP-20型號(hào)大孔吸附樹脂進(jìn)行樣品制備，綜合考慮藥效指標(biāo)和總黃酮含量，篩選經(jīng)過大孔吸附樹脂分離的不同部位，以得到具有最優(yōu)療效的中藥組分。

對(duì)LCAE進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到3個(gè)分離部位(LCA30、LCA60和LCA95)。通過高尿酸血癥小鼠模型，篩選各部位的降尿酸藥效作用，表3結(jié)果表明，LCA30和LCA60相比于粗提物L(fēng)CAE具有更優(yōu)的降尿酸藥效，說明其活性成分在這2個(gè)分離部位得到富集，其中LCA60具有最優(yōu)效果；與模型組相比，血清尿酸含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而LCA95活性較低。含量分析數(shù)據(jù)表明，LCA60中總黃酮含量最高，達(dá)到67.0%，相比初提物L(fēng)CAE和其他分離部位有明顯的優(yōu)勢(shì)。

表3 金錢草醇提物不同分離部位對(duì)高尿酸血癥模型小鼠血清尿酸含量的影響

注：(1)n=12；(2)與模型組比，*P<0.05，**P<0.01

3.3 中藥組分LCA60的藥效學(xué)研究

對(duì)篩選得到的中藥組分LCA60從降尿酸活性和抗炎活性兩個(gè)方面開展藥效學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，LCA60分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2，0.4，0.8 g·kg-1的低、中、高劑量組進(jìn)行給藥，給藥周期為7 d。分別選擇別嘌呤醇和阿司匹林作為降尿酸和抗炎的陽性藥物的對(duì)照組。表4結(jié)果表明，對(duì)小鼠耳腫脹的抑制實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)劑量組均對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹有一定的抑制作用，中、高劑量組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。對(duì)高尿酸血癥小鼠模型，3個(gè)劑量組亦有降低小鼠血清尿酸濃度作用，中、高劑量組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。藥效結(jié)果表明，高、中、低3個(gè)劑量組的LCA60表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，組分LCA60具有明確的降低血清尿酸含量和抗炎藥效作用，是從金錢草中提取分離得到的抗痛風(fēng)活性組分。

表4 金錢草活性組分LCA60的藥效學(xué)結(jié)果

注：與空白對(duì)照組比較，△△P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.4 金錢草抗痛風(fēng)活性組分LCA60的化學(xué)成分組成研究

按2.4方法對(duì)活性組分LCA60進(jìn)行測(cè)定，篩選研究結(jié)果表明，各受試物的藥效作用和總黃酮含量呈正相關(guān)，說明金錢草黃酮類化合物可能是其活性物質(zhì)。進(jìn)一步分析活性部位LCA60的化學(xué)成分組成，HPLC分析結(jié)果表明，金錢草抗痛風(fēng)組分LCA60中總黃酮含量為67.0%，其中包括有山柰酚8.4%、槲皮素7.6%、蘆丁7.3%、表兒茶素9.1%、橙皮苷8.8%。見表5、圖1。

表5 LCA60化學(xué)成分組成

圖1 金錢草活性組分LCA60 HPLC圖

4 討論

隨著人民生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。痛風(fēng)是一種代謝性疾病，難以根治，有較高的危害性，加強(qiáng)對(duì)痛風(fēng)防治藥物的研究尤為重要。筆者通過考察金錢草提取和分離工藝，結(jié)合藥效篩選和含量測(cè)定，得到中藥組分LCA60。藥效學(xué)研究結(jié)果表明，LCA60具有明顯的降低血清尿酸水平和抗炎藥效作用，其低、中、高劑量組均具有一定療效，具有良好的量效關(guān)系。有研究表明黃酮類化合物具有黃嘌呤氧化酶抑制作用[10]，可能是LCA60降低血清尿酸水平的作用機(jī)制。區(qū)別于化學(xué)合成藥物如別嘌呤醇，活性組分LCA60來源于臨床常用中草藥金錢草，具有較高的安全性。綜上所述，金錢草中活性組分LCA60具有明確的抗痛風(fēng)療效，活性成分基本清晰，安全性良好，具有進(jìn)一步開發(fā)成為抗痛風(fēng)植物藥的基礎(chǔ)。

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ExtractionSeparationandPharmacodynamicScreeningofAnti-goutActiveComponentsfromLysinwchiachristinaeHance

YAO Xuan1，2*，HEShuheng1，2，TANGYing1，2

(1.NationalEngineeringResearchCenterforTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China；2.ShanghaiTraditionalChineseMedicineTechnologyCo.，Ltd.，Shanghai201203，China)

Objective：Active ingredient content and pharmacodynamic effect were used to investigate the process route for extraction and purification，screen the anti-gout active components fromLysinwchiachristinae，and pharmacodynamic and chemical components analysis were also studied for active components.Methods：Hyperuricemia mice model was established for pharmacodynamic screening of different components of extraction and purification，and UV method was used to test content of total flavonoids of different components，which were combined to optimize the process route forL.christinae.Pharmacodynamic studies were developed to test thedose-effect relationship from uric acid reduction activity and anti-inflammatory activity of active components..The chemical composition were analyzedby HPLC methods.Results：The best extraction and separation technology for the herbs ofL.christinaewas by ethanol extraction，and separating the components by macroporous resin Diaion HP-20 with 30% ethanol washing to remove impurities.LCA60 was gained by collecting the component from 60% ethanol elution，which was selected to be the active components for decreasing the content of serum uric acidandanti-inflammatory significantly.The total flavonoids content of LCA60 was 67.0%，which contained 8.4% kaempferol，7.6% quercetin，7.3%rutin，9.1% epicatechin and 8.8% hesperidin.Conclusion：LCA60 was the active components for anti-gout，which provided theoretical foundation for the clinical application ofL.christinae.

LysinwchiachristinaeHance；Active components；Gout；Total flavonoids

2014-07-29)

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)(11DZ1970800)

*

姚譞，工程師，研究方向：中藥新藥開發(fā)、中藥藥理；E-mail：yx@nercmtcm.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.005