周艷芳，張國(guó)輝，王 好

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心研所，江蘇鎮(zhèn)江212002）

細(xì)胞衰老是不可逆的細(xì)胞周期停滯伴隨表型的改變，呈現(xiàn)特征性的衰老表型，包括細(xì)胞增大、扁平等細(xì)胞形態(tài)改變、衰老相關(guān)的β－半乳糖苷酶活性增加［1］等。細(xì)胞衰老不僅僅是生理上促進(jìn)組織、器官及機(jī)體的衰老，還具有促進(jìn)衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，靶向抑制細(xì)胞衰老可能是衰老相關(guān)疾病防治的有效新策略［2－3］。細(xì)胞衰老與壞死一樣是不可逆過(guò)程，有效降低其衰老是關(guān)鍵。目前，認(rèn)為一些酚類(lèi)物質(zhì)治療可能有效，6－姜酚是一種生姜中的多酚復(fù)合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的多重保護(hù)效應(yīng)［4－5］，且中國(guó)有飲生姜水祛老年斑（皮膚衰老表現(xiàn)）的民間驗(yàn)方。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是高血壓、冠心病等衰老相關(guān)性血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理因素，有研究顯示AngⅡ能通過(guò)AT1受體介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）衰老［6］，作者實(shí)驗(yàn)證明mTOR參與AngⅡ 誘導(dǎo)的VSMCs衰老。在本試驗(yàn)中，作者以AngⅡ作為VSMCs衰老誘導(dǎo)劑，探討6－姜酚對(duì)AngⅡ介導(dǎo)VSMCs衰老的干預(yù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量120～150g的雄性SD大鼠，由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物與試劑 DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），南美胎牛血清（HyClone，美國(guó)），AngⅡ（Tocris，美國(guó)），6－姜酚（Merck，德國(guó)），細(xì)胞衰老相關(guān)的β－半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒（碧云天，中國(guó)），RNaseA、碘化丙啶（Amresco，美國(guó)），兔單克隆mTOR抗體、磷酸化P70－S6K抗體（Cell Signal Technique，美國(guó)）及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（Cell Signal Technique，美國(guó)），山羊多克隆AT1抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊IgG（Santa Cruz，美國(guó)），超敏ECL顯色試劑盒（Pierce，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠主動(dòng)脈VSMCs的分離培養(yǎng)及處理 取體質(zhì)量120～150g的雄性SD大鼠，斷頭處死，無(wú)菌條件下取胸主動(dòng)脈，縱向剪開(kāi)，剝離血管外膜及內(nèi)膜，中膜剪成1～3mm大小組織塊，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、100%濕度的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，獲得純度90%以上的VSMCs（免疫細(xì)胞化學(xué)抗α－SMA染色）。第3～8代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，給予AngⅡ處理細(xì)胞（AngⅡ組），或以6－姜酚預(yù)處理細(xì)胞1h，再給予AngⅡ處理（6－姜酚組）。然后進(jìn)行細(xì)胞衰老相關(guān)的β－半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，或提取蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡法（Western blot）分析蛋白表達(dá)。

1.3.2 β－半乳糖苷酶染色 按試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，經(jīng)處理48h的6孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗1次，加1mLβ－半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15min，PBS洗3次。每孔加1mL染色工作液，37℃孵育過(guò)夜，相差纖維鏡下（×400）觀察并攝片。分別選擇8～10個(gè)視野，計(jì)數(shù)衰老和正常細(xì)胞數(shù)（共計(jì)數(shù)100個(gè)），計(jì)算衰老陽(yáng)性率［衰老細(xì)胞陽(yáng)性率（%）＝衰老陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／100個(gè)細(xì)胞×100%］。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化 細(xì)胞以2×104個(gè)密度接種于6孔板，培養(yǎng)24h，用藥物處理到設(shè)定的時(shí)間，以0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 000×g離心5min，PBS洗滌3次，500μL預(yù)冷的70%乙醇4℃過(guò)夜固定。PBS洗滌2次，100μL的PBS重懸細(xì)胞，加入RNaseA（終濃度100μg／mL），37℃孵育30min，加入碘化丙啶染色液（終濃度50μg／mL），常溫避光染色1h，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司FACS Calibur）檢測(cè)分析細(xì)胞周期變化。

1.3.4 Western blot檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，加入冰冷細(xì)胞裂解液100μL（5倍細(xì)胞球體積），靜置30min，超聲粉碎4次，13 000r／min離心30min，提取總蛋白并用Bradford法測(cè)蛋白濃度，40μg蛋白上樣行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加一抗4℃過(guò)夜。二抗室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色后凝膠成像儀（Bio－Rad公司，美國(guó)）捕獲圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以s表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6－姜酚降低AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs衰老 β－半乳糖苷酶活性被證明是衰老細(xì)胞的一個(gè)特征性的生物標(biāo)志物［7］。作者以1×10－6mol／L AngⅡ處理細(xì)胞48h，β－半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示：未經(jīng)刺激的細(xì)胞偶見(jiàn)染色陽(yáng)性細(xì)胞，AngⅡ刺激后染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及染色程度顯著增加，與AngⅡ刺激的細(xì)胞相比較，6－姜酚預(yù)處理的細(xì)胞β－半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及染色程度均隨6－姜酚濃度升高而顯著降低，見(jiàn)圖1，表1。表明6－姜酚可以保護(hù)VSMCs抵抗AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。以下的機(jī)制探討中均以終濃度1×10－5mol／L的6－姜酚作為干預(yù)條件。

圖1 β－半乳糖苷酶染色結(jié)果（X－Gal法，×400）

表1 不同濃度AngⅡ 對(duì)VSMCs衰老的影響（n＝3）

2.2 6－姜酚對(duì)AngⅡ處理的VSMCs細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞周期停滯是衰老細(xì)胞的一個(gè)顯著特征，VSMCs經(jīng)AngⅡ（10－6mol／L）處理 48h后 G0／G1期停滯的細(xì)胞由對(duì)照的60.77%上調(diào)至82.50%，而S期則由14.23%降至6.35%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；6－姜酚（10－5mol／L）干預(yù)后則G0／G1期細(xì)胞下調(diào)至63.40%，S期上調(diào)至11.22%，見(jiàn)圖2。

2.3 6－姜酚對(duì)AT1受體表達(dá)的影響 有研究證明AngⅡ通過(guò)其AT1受體介導(dǎo)細(xì)胞衰老，本實(shí)驗(yàn)顯示 AngⅡ（10－6mol／L）刺激的細(xì)胞 AT1表達(dá)上調(diào)，6－姜酚（10－5mol／L）預(yù)處理未影響AngⅡ誘導(dǎo)的AT1蛋白表達(dá)。6－姜酚處理對(duì)正常培養(yǎng)的細(xì)胞AT1表達(dá)水平亦無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖3。

圖2 6－姜酚對(duì)AngⅡ處理的VSMCs細(xì)胞周期的影響

圖3 6－姜酚對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體蛋白表達(dá)的影響

2.4 6－姜酚對(duì)mTOR蛋白表達(dá)及底物P70－S6K磷酸化水平的影響 單獨(dú)6－姜酚處理的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞比較，mTOR表達(dá)及P70－S6K磷酸化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但與單獨(dú) Ang Ⅱ （10－6mol／L）刺激的細(xì)胞比較，6－姜酚（10－5mol／L）預(yù)處理的細(xì)胞mTOR表達(dá)水平則顯著降低（P＜0.05）；AngⅡ刺激而升高的P70－S6K磷酸化水平顯著回落，見(jiàn)圖4。

圖4 6－姜酚預(yù)處理對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的mTOR蛋白表達(dá)及P70－S6K蛋白磷酸化水平的影響

3 討 論

生姜具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用，6－姜酚是生姜的主要活性成分之一，是一種多酚復(fù)合物；體外細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示6－姜酚除有抗炎、抗氧化效應(yīng)，還具有抗血小板、降脂、降壓等多重心血管損傷保護(hù)作用［8］。本研究利用AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs衰老模型顯示6－姜酚能顯著抑制模型細(xì)胞的衰老樣表型改變（圖1），表明6－姜酚可保護(hù)VSMCs抵抗AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，這利于VSMCs保持正常的細(xì)胞功能進(jìn)而維持血管穩(wěn)態(tài)。AngⅡ通過(guò)AT1受體介導(dǎo)VSMCs衰老［6］，而本研究6－姜酚處理對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體表達(dá)并無(wú)顯著影響（圖3），提示6－姜酚降低AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs衰老可能不依賴(lài)于AT1受體，而是作用于受體后信號(hào)分子。mTOR作為細(xì)胞生長(zhǎng)代謝中的一個(gè)中心控制者［9］，除可通過(guò)磷酸化使其下游底物活化而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)及存活等，還可調(diào)節(jié)一些細(xì)胞型的衰老過(guò)程［10－11］，是衰老相關(guān)疾病治療的潛在靶點(diǎn)［12］。本研究結(jié)果顯示6－姜酚可以顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的mTOR升高（圖4）及底物P70－S6K磷酸化，提示抑制 mTOR／P70－S6K途徑可能是6－姜酚保護(hù)VSMCs抵抗AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老的機(jī)制之一。該結(jié)果與最近報(bào)道的mTOR抑制劑雷帕霉素抵抗某些細(xì)胞或動(dòng)物衰老的結(jié)果一致［13－15］，提示6－姜酚可能有一定的類(lèi)雷帕霉素的抗衰老作用。生姜是中國(guó)人民普遍使用的調(diào)味食物，價(jià)廉而又不良反應(yīng)少，易于推廣使用，這為衰老相關(guān)心血管疾病的防治提供了一個(gè)非常有益的提示。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)探討了生姜主要活性成分之一的6－姜酚對(duì)體外VSMCs衰老的影響，進(jìn)一步深入研究生姜及其主要成分對(duì)血管細(xì)胞衰老的影響及在體內(nèi)效果可能會(huì)發(fā)掘出生姜這一食用植物對(duì)血管衰老的確切防治作用，并產(chǎn)生意想不到的現(xiàn)實(shí)意義。

總之，本研究就6－姜酚在VSMCs衰老的作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示6－姜酚可降低AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs衰老，該作用可能部分是通過(guò)抑制mTOR／P70－S6K而實(shí)現(xiàn)，6－姜酚的這一作用為衰老相關(guān)的心血管疾病的防治提供了新的思路。

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