陳媛 吳楣 藍(lán)紅梅 等

[摘要] 目的 建立氯達(dá)軟膏、利唑軟膏、硫磺軟膏醫(yī)院軟膏劑微生物限度檢查方法。 方法 按《中國(guó)藥典》2010年版二部微生物限度檢查法中對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 氯達(dá)軟膏和利唑軟膏細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查采用薄膜過(guò)濾法，控制菌檢查均采用薄膜過(guò)濾法；硫磺軟膏細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查采用培養(yǎng)基稀釋法，控制菌金黃色葡萄球菌檢查采用培養(yǎng)基稀釋法，銅綠假單胞菌檢查采用常規(guī)法。 結(jié)論 醫(yī)院軟膏制劑必須通過(guò)方法驗(yàn)證試驗(yàn)建立合理的檢驗(yàn)方法，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[關(guān)鍵詞] 微生物限度；方法驗(yàn)證；回收率； 醫(yī)院制劑；軟膏

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）12-105-03

氯達(dá)軟膏、利唑軟膏、硫磺軟膏作為梅縣慢性病防治院常用的醫(yī)生處方藥，在臨床被廣泛應(yīng)用，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證，為控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保安全用藥，本文按照《中國(guó)藥典》2010年版二部規(guī)定[1]進(jìn)行微生物方法學(xué)驗(yàn)證。根據(jù)制劑抑菌活性的強(qiáng)弱和對(duì)不同菌種抑菌程度的大小選擇適當(dāng)?shù)臋z查方法，加入5種驗(yàn)證試驗(yàn)菌株：枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球、白色念珠菌、黑曲霉菌于氯達(dá)軟膏、利唑軟膏和硫磺軟膏中，對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率進(jìn)行驗(yàn)證，建立氯達(dá)軟膏、利唑軟膏和硫磺軟膏細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢出方法；控制菌以加入2種驗(yàn)證試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌進(jìn)行檢出實(shí)驗(yàn)，建立氯達(dá)軟膏、利唑軟膏和硫磺軟膏控制菌檢查方法。

1 試藥與儀器

1.1 試驗(yàn)樣品

氯達(dá)軟膏（批號(hào)分別為130629，130712，130718；利唑軟膏（批號(hào)分別為13720，130625，130723），硫磺軟膏（批號(hào)分別為130610，130615，130623）均由梅縣慢性病防治院提供。

1.2 驗(yàn)證用儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、BSC-1300ⅡA2生物安全柜、DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HCB602H電子分析天平（0.01g）、ZW-808A微型智能集菌儀、一次性無(wú)菌過(guò)濾器、ZW-808D智能勻漿儀、臥式滅菌器、HH.Bll.500-電熱恒溫培養(yǎng)箱、SPX-150型生化培養(yǎng)箱等

1.3 試驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501-2a1]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003-5a]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102-3a]、白色念珠菌[CMCC（F）98001-3a]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104-2a]黑曲霉[CMCC（F）98003-1a]均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，以上菌株傳代次數(shù)均不超過(guò)5代。

1.4 驗(yàn)證用培養(yǎng)基及稀釋劑

pH=7.0的氯化鈉一蛋白胨緩沖液（批號(hào)：1112292）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：3101032）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：201112262）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)：3101466）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：3101223）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：201112231）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)：3101078）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：120315），溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：110223）均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司或廣東環(huán)凱微生物有限公司出品。其他試劑均為分析純或化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備[1-12]

接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度（34±1）℃，培養(yǎng)24h，接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，培養(yǎng)46h，將上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，培養(yǎng)6d，加入4mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1毫升含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。

2.2 供試品溶液制備[1-12]

氯達(dá)軟膏、利唑軟膏供試液：取氯達(dá)軟膏10.12g、利唑軟膏9.95g，分別加至含20mL無(wú)菌十四烷酸異丙酯和無(wú)菌玻璃珠的二個(gè)三角瓶中，充分振搖使供試品溶解后，各加入45℃的pH=7.0的無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液100mL，振搖6min，靜置使油水明顯分層，取其水層，作為1∶10的供試液。

硫磺軟膏供試液：取硫磺軟膏5.05g，加至含溶化的（溫度不超過(guò)45℃）5g司盤(pán)80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無(wú)菌混合物的燒杯中，用無(wú)菌玻棒攪拌成團(tuán)后，加入45℃ 的pH=7.0的無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液至100mL，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1︰20的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證[1-12]

試驗(yàn)組：取按“2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液1mL和試驗(yàn)菌液1mL按常規(guī)法：取供試液1mL注皿；培養(yǎng)基稀釋法：取供試品溶液1mL注入10個(gè)平皿（0.1mL/皿）；離心法：取一定量的供試品溶液，以500 r/min離心5min，取上清液試驗(yàn)；薄膜過(guò)濾法：取供試品溶液1mL，采用薄膜過(guò)濾法，依法檢查，以pH=7.0的無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液為沖洗液。

菌液組：取1mL試驗(yàn)組中相同稀釋級(jí)的菌懸液，同法測(cè)定其菌數(shù)，得出試驗(yàn)組中加入的菌數(shù)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，計(jì)算平均菌落數(shù)。

供試品對(duì)照組：取與試驗(yàn)組同一供試品溶液和方法，不加菌液，測(cè)定樣品本底菌。

稀釋劑對(duì)照組：用pH=7.0的無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，按試驗(yàn)組的方法測(cè)定其菌落數(shù)。

計(jì)算公式：

結(jié)果判斷：稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率應(yīng)均不低于70%，若3次獨(dú)立平行試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率均不低于70%，則說(shuō)明可照該供試品溶液制備方法和計(jì)數(shù)方法測(cè)定該供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70%，則說(shuō)明所采用的方法不可行，應(yīng)改用其他方法（離心法、中和法、薄膜過(guò)濾法等）消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1（表中薄膜過(guò)濾法：沖洗量為100mL×3次。）

上表試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)樣品中的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌3個(gè)菌株回收率試驗(yàn)，氯達(dá)軟膏、利唑軟膏抑菌作用較強(qiáng)，需采用離心法+薄膜過(guò)濾法聯(lián)用消除供試品的抑菌活性；而硫磺軟膏則用培養(yǎng)基稀釋法0.1mL/皿，回收率能達(dá)到70%以上；氯達(dá)軟膏、利唑軟膏白色念珠菌和黑曲霉的回收率試驗(yàn)需用離心法+薄膜過(guò)濾法聯(lián)用、硫磺軟膏用培養(yǎng)基稀釋法（0.1mL/皿）回收率才能達(dá)到70%以上。

2.4 控制菌檢查法的驗(yàn)證

試驗(yàn)組： 取 “2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液10mL和50～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

陰性對(duì)照組： 除菌液為大腸埃希氏菌1mL（10～100cfu），方法同試驗(yàn)組。

上表試驗(yàn)結(jié)果表明，氯達(dá)軟膏與利唑軟膏因其抑菌作用較強(qiáng)，只能采用離心法+薄膜過(guò)濾法檢查金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌；硫磺軟膏用培養(yǎng)基稀釋法檢查金黃色葡萄球菌（200mL）及常規(guī)法檢查銅綠假單胞菌。

3 討論

上述細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證及控制菌檢查法的驗(yàn)證數(shù)據(jù)表明，3種醫(yī)院外用軟膏制劑均不能按常規(guī)法檢查微生物限度， 抑菌作用較強(qiáng)的品種氯達(dá)軟膏和利唑軟膏需要采用離心法+薄膜過(guò)濾法進(jìn)行微生物限度檢查，而硫磺軟膏則用培養(yǎng)基稀釋法可進(jìn)行微生物限度檢查。

軟膏劑供試品的制備一直比較繁瑣，筆者采用中國(guó)藥典規(guī)定非水溶性供試品的兩種制備方法，發(fā)現(xiàn)平皿法測(cè)定供試品時(shí)，用藥典規(guī)定的方法1更適合；方法2的十四烷酸異丙酯容易與一次性塑料培養(yǎng)皿發(fā)生反應(yīng)，使培養(yǎng)皿表面變白，難以計(jì)數(shù)。因此，在2.2 供試品溶液制備中采用了兩種供試品溶液制備方法。

采用藥典規(guī)定非水溶性供試品的方法2時(shí)，如供試品難溶，可嘗試用勻漿儀低速檔混溶，在供試品的沖洗液中加入1%無(wú)菌聚山梨酯80[13]，可以明顯減少薄膜上藥物的殘留，使計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確。

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（收稿日期：2014-03-13）