劉 佳，楊啟華

（1. 中國科學院 大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023；2. 中國科學院大學 化學與化工學院，北京 100029）

介孔材料固定化酶的研究進展及其應用前景

劉 佳1，2，楊啟華1

（1. 中國科學院 大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023；2. 中國科學院大學 化學與化工學院，北京 100029）

評述了介孔材料固定化酶的研究新進展，重點分析了酶分子被固載到介孔材料的納米孔中后，載體孔徑尺寸和納米孔微環(huán)境對固定化酶催化活性及其穩(wěn)定性可能產(chǎn)生的影響。同時，以水解酶和氧化還原酶為例，對介孔材料固定化酶在生物柴油制備、生物質(zhì)轉化、手性藥物及精細化學品合成、生物燃料電池及生物傳感器制備等領域的應用前景進行了展望。

生物催化；硅基介孔材料；酶固定化

酶是生物體細胞內(nèi)產(chǎn)生的具有催化功能的特殊蛋白，在常溫常壓下可高效率、高專一性地催化各種生物化學反應，促進生物體的新陳代謝。模仿自然界，用以酶為催化劑的生物催化技術取代傳統(tǒng)的化學品生產(chǎn)方式，是實現(xiàn)資源利用生態(tài)化和可持續(xù)發(fā)展的重要趨勢。研究者們普遍認為，生物催化將是繼醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)革命之后，生物技術革命的第三個浪潮，以生物催化為核心的工業(yè)生物技術在支撐社會進步和經(jīng)濟發(fā)展的技術體系中的地位已經(jīng)被提到了空前的戰(zhàn)略高度［1］。盡管酶的工業(yè)開發(fā)和利用是當代生物技術革命的重要課題，但目前可大規(guī)模生產(chǎn)和應用的商品酶只有數(shù)十種。天然酶在工業(yè)應用上受到限制的主要原因有：大多數(shù)酶脫離其生理環(huán)境后極不穩(wěn)定，生產(chǎn)應用過程中的條件會使酶失活；酶的分離純化工藝復雜，會對反應體系造成污染且無法實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)；酶制劑的成本較高［2］。為解決上述問題，酶的固定化技術應運而生。所謂酶的固定化是指將自由的酶分子束縛或限域在一定空間內(nèi)，但仍保留其催化特性并可回收使用的一類技術［3］。固定化酶在技術上的顯著優(yōu)勢使得該領域的研究受到廣泛關注，氧化硅基介孔材料的出現(xiàn)為酶的固定化開辟了新的發(fā)展空間。氧化硅基介孔材料具有在2～50 nm內(nèi)連續(xù)可調(diào)的孔徑、較大的比表面積和孔體積、易調(diào)變的孔道化學組成、良好的生物兼容性及穩(wěn)定性等優(yōu)點，是固定化酶的理想載體［4-6］。1996年，Diaz等［7］研究組首次報道了幾種球形蛋白（細胞色素C、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）在孔徑為4 nm的有序介孔材料MCM-41上的物理吸附。十幾年來，隨著新型介孔材料的不斷涌現(xiàn)、新的固定化酶反應體系的不斷拓展以及對影響固定化酶性能的相關因素的逐漸深入探索，介孔材料固定化酶的研究領域取得了一系列進展。

本文通過概述影響固定化酶催化活性及其穩(wěn)定性的關鍵因素，介紹了氧化硅基介孔材料固定化酶的研究進展，并對其在工業(yè)生物催化中的應用前景進行了展望。

1 介孔材料固定化酶的影響因素

1.1 孔徑

大量研究表明，介孔材料納米孔的孔徑大小會對固定化酶的吸附量、活力保留及穩(wěn)定性產(chǎn)生直接影響［8-9］。當載體的孔徑遠小于酶分子的直徑時，酶分子不易被固載到載體的納米孔中，而主要分布于載體的外表面，因此無法利用孔壁對酶分子起到保護作用。但當載體的孔徑遠大于酶分子的直徑時，對于通過物理吸附作用（疏水作用、靜電作用、氫鍵及范德華力）固載到納米孔中的酶，酶與載體之間的弱相互作用難以有效地將酶分子穩(wěn)定在納米孔中，酶的流失較嚴重。因此，一般認為當介孔材料納米孔的直徑略大于酶的分子尺寸時，所得的固定化酶更容易表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性［10］。

Takahashi等［11］分別以具有不同孔徑的FSM-16，MCM-41，SBA-15介孔材料為載體，詳細考察了介孔材料的孔徑大小對其固載辣根過氧化物酶（HRP，分子直徑約4.6 nm）的影響。研究結果表明，當以孔徑較小的FSM-16介孔材料（孔徑為2.7 nm）為載體時，酶的吸附量較低。他們認為這是由于酶分子無法進入載體的孔道內(nèi)部，而僅吸附在介孔材料的外表面所致。Lykourinou等［12］研究發(fā)現(xiàn)，當載體的孔徑（1.3 nm）略小于細胞色素C酶蛋白（2.6 nm×3.2 nm×3.3 nm）的分子尺寸時，細胞色素C酶蛋白可在發(fā)生一定的構型變化后進入到載體的納米孔中。經(jīng)熒光光譜表征，他們進一步發(fā)現(xiàn)存在于納米孔中的細胞色素C酶蛋白的構型介于其天然構型與完全失活的構型之間。Liu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，分子尺寸為3 nm×4 nm×5 nm的洋蔥假單細胞菌脂肪酶（PCL）可通過簡單的物理吸附作用進入孔口尺寸（小于4 nm）略小于PCL直徑的FDU-12材料中，且所得的固定化酶可在外消旋苯乙醇的手性拆分反應中循環(huán)使用多次。

由此可以推測，當載體的孔徑遠小于酶分子尺寸時，酶通過解折疊等構型變化的方式進入納米孔中會變得較困難，因此可以通過先吸附酶、后縮小孔口尺寸的方法來實現(xiàn)介孔材料對酶分子的封裝。具體地說，首先選取孔徑略大于酶分子直徑的介孔材料作為載體，在將酶分子吸附到納米孔中后，通過硅烷化處理大幅縮小載體的孔口直徑，使其遠小于酶分子的尺寸（同時大于底物及產(chǎn)物分子的尺寸），從而將酶分子物理限域在納米孔內(nèi)，防止其在反應過程中從納米孔內(nèi)流失到反應溶液中。Ma等［14-15］采用具有二維六方相直形孔道的MCM-41介孔材料作為載體，首先將豬胰腺脂肪酶（PPL）吸附到MCM-41介孔材料的納米孔中，然后以乙烯基三甲氧基硅烷為硅烷化試劑，與MCM-41介孔材料孔口處的表面硅羥基進行反應，可有效地將載體的孔口尺寸從4.5 nm縮小到1.4 nm，從而將PPL封裝在MCM-41介孔材料的納米孔道中。循環(huán)實驗證明，采用該方法得到的固定化酶具有更高的循環(huán)穩(wěn)定性。但由于在封口過程中會產(chǎn)生甲醇等對酶的活性有毒害作用的試劑，經(jīng)過封口處理的固定化酶活力僅為自由酶活力的40%。最近，Liu等［13］以具有三維聯(lián)通籠形孔道結構的FDU-12材料（納米籠直徑為17 nm，孔口尺寸小于4 nm）為載體，以六甲基二硅氮烷（HMDS）為硅烷化試劑，在30 ℃的溫和條件下對吸附有PCL的FDU-12載體進行封口（見圖1）。

圖1 酶分子在FDU-12材料的納米籠內(nèi)的封裝及其在兩相生物催化反應中的應用［13］Fig.1 Schematic diagram of encapsulating enzymes into the nanocage of FDU-12 for performing biphasic biocatalytic reactions［13］.HMDS：hexamethyldisilazane.

UV-Vis表征結果顯示，采用該方法可成功地將PCL封裝在FDU-12的納米籠內(nèi)，有效抑制其在催化反應中的流失。同時由于FDU-12材料特殊的籠形孔道結構及封口過程中避免了甲醇等有害試劑的產(chǎn)生，該封裝方法可有效地保持PCL的催化活性。活性測試結果表明，封口后PCL的活力為自由酶活力的1.7倍。此外，HMDS修飾不僅能將PCL封裝在FDU-12材料的納米籠中，同時還可將FDU-12材料的外表面由親水性轉變?yōu)殡p親性，所得的固體催化劑顆?？捎行У胤€(wěn)定在水/油兩相界面，為制備固體乳液（Pickering emulsion）及進行兩相生物催化提供了一種新的途徑（見圖1）。

1.2 納米孔微環(huán)境

酶分子對其周圍環(huán)境條件非常敏感，酶所催化的生物化學反應都是在特定的微環(huán)境內(nèi)發(fā)生的。在細胞中，酶分子周圍的細胞液中除分散著各種各樣的細胞器外，還充斥著大量的蛋白、核酸、多糖等，同時酶分子周圍的微環(huán)境都具有特定的親疏水性、氧化還原性、離子強度、pH等，這些特定的微環(huán)境是保證細胞內(nèi)的酶具有高催化活性、高選擇性及高穩(wěn)定性的關鍵因素［16-18］。當酶分子被固載到介孔材料中后，介孔材料納米孔內(nèi)的環(huán)境就構成了固定化酶的微環(huán)境。研究結果表明，納米孔微環(huán)境會直接影響酶與載體之間的相互作用、酶分子的構型及空間取向、酶分子構象變化的自由度以及酶分子活性中心附近的微環(huán)境等［8，19-20］。因此，載體納米孔的微環(huán)境是否適宜直接決定著固定化酶的活性、穩(wěn)定性及選擇性，要獲得高催化性能的固定化酶，就需對介孔材料納米孔的微環(huán)境進行精心設計，以盡可能接近細胞內(nèi)酶分子的微環(huán)境。

據(jù)研究，細胞質(zhì)內(nèi)大分子的總質(zhì)量濃度高達300～400 g/L，占據(jù)細胞體積的20%～40%，細胞內(nèi)的酶分子就是在這種擁擠的環(huán)境中完成催化反應的。Minton等［21-22］從1981年開始對這種擁擠的細胞內(nèi)微環(huán)境及其對酶的構型、活性和穩(wěn)定性的影響進行了一系列的研究，并提出大分子擁擠應當與pH、離子強度、溶液組成等一樣被作為酶性能研究中的一項常規(guī)因素。雖然目前在酶溶液中添加惰性大分子試劑來模擬細胞中的擁擠微環(huán)境已經(jīng)引起越來越多生物學家和化學家的重視，但在固定化酶的研究中，相關的文獻報道還非常少，而且僅有的一些報道主要是針對包埋在硅膠中的酶分子進行的［23］。最近，Liu等［24］在研究通過利用聚合物分子對介孔材料納米孔的修飾來控制固定化酶周圍空間的擁擠程度時發(fā)現(xiàn)，提高固定化酶微環(huán)境的擁擠程度，可有效抑制高溫引起的酶的解折疊，提高固定化酶的穩(wěn)定性，但同時擁擠的微環(huán)境又會因干擾酶分子的二級結構而產(chǎn)生負面作用。此外，擁擠的納米孔微環(huán)境可增強酶分子與底物的親和能力，促使反應平衡向形成酶-底物復合物的方向移動，從而加快酶促反應速率，但又會因增加產(chǎn)物和底物在納米孔道內(nèi)的擴散阻力而使反應速率下降。總之，無論是對于酶的活性還是穩(wěn)定性，擁擠的納米孔微環(huán)境都是一把雙刃劍。利用聚合物大分子對介孔材料的納米孔進行修飾，可有效地模擬細胞中的擁擠微環(huán)境；同時，通過調(diào)變聚合物的引入量可精確控制固定化酶周圍環(huán)境的擁擠程度，從而調(diào)變大分子擁擠效應所帶來的兩個相反作用的平衡，使固定化酶的活性和穩(wěn)定性同時得到提高。

納米孔內(nèi)的化學微環(huán)境（如表面親/疏水性等）也是影響固定化酶催化性能的重要因素。由于酶分子表面既有親水性的極性氨基酸殘基又有疏水性的非極性氨基酸殘基，因此載體表面的親/疏水性平衡直接決定著酶與載體之間疏水作用的強弱［9］。Park等［25］將青霉素G酰化酶（PGA）負載到一系列巰基、醛基、羧基、苯基、乙烯基修飾的SBA-15介孔材料中，發(fā)現(xiàn)乙烯基修飾的SBA-15介孔材料對PGA具有最高的吸附量及最低的米氏常數(shù)，表明疏水性的介孔材料表面可與PGA表面的疏水性基團形成強的疏水作用，且該作用對固定化PGA的活力產(chǎn)生了影響。以脂肪酶和PGA為例，通過調(diào)變載體表面的親/疏水性可以調(diào)變酶分子活性構象與非活性構象之間的平衡，從而使固定化酶的催化活性產(chǎn)生較大差別。當酶的穩(wěn)定性受酶的構象控制時，載體表面的親/疏水性平衡也會對固定化酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生很大影響。如將堿性磷酸酶負載到非極性基團修飾的載體上時，其穩(wěn)定性大幅降低，其原因可能是載體與酶分子之間的疏水作用導致酶分子從天然構象向松散的、不穩(wěn)定的構象轉變［26］。然而，當將脂肪酶分子負載到疏水性介孔材料中時，載體表面與脂肪酶分子表面的大面積的疏水作用可以增強酶分子的剛性，對酶分子的活性構象起到很好的穩(wěn)定作用，因此所得固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性和循環(huán)穩(wěn)定性均會顯著提高。此外，由于酶分子表面親/疏水性基團集中的區(qū)域不同，酶被吸附到親/疏水性不同的載體上時可能會產(chǎn)生不同的空間取向，從而影響酶活性中心的可及性及固定化酶的催化活性［27］。

Liu等［28-29］研究表明，與有機小分子相比，采用聚合物大分子對納米孔化學微環(huán)境進行修飾具有獨特的優(yōu)越性：1）與有機小分子官能團（如丙基、苯基、氨基、羧基等） 相比，聚合物對介孔材料的修飾更加多樣化，也更加精細。通過調(diào)變聚合物單體的種類、相對比例及引入量，可對納米孔表面的化學性質(zhì)進行高度精確的微調(diào)控，從分子層次對固定化酶的化學微環(huán)境進行精確調(diào)變。如將具有不同親/疏水性的環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷形成的長鏈嵌段聚合物化學鍵合到介孔二氧化硅的納米孔內(nèi)，從而對固定化脂肪酶微環(huán)境的親/疏水性平衡進行精確調(diào)控［28］。研究發(fā)現(xiàn)，與親水性和強疏水性的載體微環(huán)境相比，中等強度疏水性的載體微環(huán)境（水蒸氣與苯蒸氣的吸附摩爾比為0.41）對PCL最為適宜，這種微環(huán)境既能誘發(fā)PCL的界面激活作用，又不會破壞其活性中心，從而可以使PCL表現(xiàn)出最高的活力和穩(wěn)定性。2）某些聚合物具有特殊的環(huán)境-響應性能，能夠對外界環(huán)境中的微小刺激信號（如溫度、pH、離子強度、磁場、光照、化學物質(zhì)等）的變化產(chǎn)生快速響應，在結構物理性能及化學性能上發(fā)生突變。利用這一特殊性質(zhì)，將環(huán)境-響應聚合物修飾到介孔材料中，可以實現(xiàn)對納米孔微環(huán)境的原位調(diào)變。在眾多具有環(huán)境-響應性能的聚合物中，聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）是一種非常典型的溫控-響應聚合物，它在最低臨界溫度（32 ℃）附近能發(fā)生可逆的體積相變行為。當溫度低于32 ℃時，PNIPAM在水溶液中為伸展的鏈狀，呈現(xiàn)親水性；但當溫度高于32 ℃時，PNIPAM在水溶液中會收縮團聚成小球狀，呈現(xiàn)疏水性。在最近的研究中，Liu等［29］合成了PNIPAM-二氧化硅雜化介孔材料，通過化學鍵合在納米孔內(nèi)的PNIPAM的溫控-響應收縮，可以原位地為固定化酶分子形成擁擠且疏水的微環(huán)境（見圖2）。通過測試固定化酶的活性和穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，這種具有溫控-響應性能的介孔材料可大幅提高PCL和南極假絲酵母菌脂肪酶B（CALB）的熱穩(wěn)定性。當在70 ℃下熱處理2 h后，固載在溫控-響應納米孔內(nèi)的PCL的活力不僅沒有降低，反而比熱處理前提高了15倍。同樣，在70 ℃下熱處理2 h后，固載在溫控-響應納米孔內(nèi)的CALB在外消旋苯乙醇的動力學拆分中仍表現(xiàn)出遠高于自由酶的催化活性。這可能是因為熱處理引起孔道內(nèi)的PNIPAM收縮，使納米孔內(nèi)微環(huán)境的疏水性顯著增強，激發(fā)了固定化PCL的“界面激活”作用。此外，聚合物鏈纏繞和包裹住周圍的酶分子，有效模擬了細胞內(nèi)的擁擠微環(huán)境，避免酶分子因解折疊而失活，同時也為酶分子提供了一個隔絕外界極端環(huán)境的防護層。他們的研究表明，將溫控-響應聚合物PNIPAM引入到介孔材料的納米孔中，可以對固定化酶的催化性能產(chǎn)生十分有益的影響，為制備高效、高穩(wěn)定性的多相生物催化劑提供了一種新的途徑。

圖2 PNIPAM聚合物在高溫下對固定化酶起保護作用的示意［29］Fig.2 Illustration of the protective effect of PNIPAM polymer on immobilized enzymes at high temperature［29］.PNIPAM：poly(N- isopropyl acrylamide).

2 介孔材料固定化酶在生物催化中的應用前景

最新的研究報告表明，2010年世界范圍內(nèi)工業(yè)用酶的市場已超過33億美元，且會以每年7%～9%的增速在2015年達到45～50億美元［30］。可以預計，介孔材料固定化酶研究工作的不斷深入，可為制備高活性、高穩(wěn)定性的多相生物催化劑提供新的有效途徑，酶制劑的工業(yè)化應用也會取得更快、更大的發(fā)展。

2.1 固定化水解酶

由于水解酶在生物柴油、生物質(zhì)轉化、手性藥物及精細化學品的合成等領域具有很高的應用價值，因此目前水解酶在介孔材料上的固定化研究備受關注。纖維素酶可以催化纖維素類生物質(zhì)向葡萄糖轉化，研究者們通過物理吸附或化學鍵合等方法，已成功地將纖維素酶固載到一系列介孔材料（如SBA-15、有機官能團修飾的FDU-12和MCF等材料）中。Chang等［31］將纖維素酶通過化學鍵合的方式固載到羧基修飾的孔徑達40 nm的介孔材料中，用所得的固定化酶催化纖維素水解為葡萄糖的轉化率高達80%，且在使用過程中該固定化酶表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

與化學法生產(chǎn)過程相比，通過脂肪酶催化的酯交換工藝，將自然界產(chǎn)生的油料作物、動物油脂以及餐飲垃圾油等制成可代替石化柴油的再生性柴油燃料，具有條件溫和、醇用量小、無污染排放等優(yōu)點，是工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向。Salis等［32］分別采用物理吸附和化學鍵合的方法將熒光假單胞菌脂肪酶固載到SBA-15介孔材料中，所得的固定化酶可在溫和的反應條件下，7 h內(nèi)將葵花籽油近100%地催化醇解轉化。此外，他們還發(fā)現(xiàn)用化學鍵合法制得的固定化酶具有良好的穩(wěn)定性，可以循環(huán)使用20次以上。

利用酶的高度立體選擇性進行外消旋體拆分以獲得光學純的化合物是制備手性藥物的重要途徑。與自由酶相比，固定化酶具有可循環(huán)使用、操作穩(wěn)定性好等特點，因此在手性藥物的工業(yè)生產(chǎn)中具有更高的應用價值。光學純扁桃酸是市場潛力巨大的藥物和精細化工中間體，Itoh等［33-34］將脂肪酶固載到甲基丙烯酸修飾的SBA-15介孔材料中，對外消旋扁桃酸甲酯進行手性拆分（見圖3）。以離子液體為反應溶劑，所得產(chǎn)物（R）-（-）-扁桃酸甲酯對映體過量值（ee）高達99%。手性N取代的苯基-α-氨基丙酸也是一類重要的手性合成中間體，特別是在農(nóng)藥領域，是很多手性農(nóng)藥合成中的關鍵中間體。以2-［（2-甲基-6-乙基）苯基氨基］丙酸（NEMPA）為模型化合物，Zheng等［35］采用手性選擇性相反的兩種脂肪酶催化串聯(lián)反應，同時合成出光學純的（S）-NEMPA和（R）-NEMPA，反應過程見圖4。即以外消旋的2-［（2-甲基-6-乙基）苯基氨基］丙酸甲酯（NEMPA-ME）為底物，首先用固載在SBA-15介孔材料中的PCL催化外消旋的NEMPA-ME水解，得到光學純的（S）-NEMPAME和（R）-NEMPA，ee＞99%；然后以CALB為催化劑，將（S）-NEMPA-ME進一步轉化為（S）-NEMPA，ee=98%。

圖3 固定化脂肪酶催化外消旋扁桃酸甲酯的手性拆分反應［33-34］Fig.3 Transesteri fi cation of methyl(±)-mandelate and vinyl acetate catalyzed by immobilized lipase［33-34］.

圖4 固載在SBA-15介孔材料中的PCL和CALB共同催化的兩步法制備光學純NEMPA的過程［35］Fig.4 Preparation process of (S)-(-)-NEMPA by two-step resolution using lipase from Pseudomonas cepacia(PCL) and lipase B from Candida antarctica(CALB) immobilized on SBA-15［35］.

2.2 固定化氧化還原酶

氧化還原酶是一種催化電子由一個分子（即還原劑，又叫氫受體或電子供體）傳送至另一個分子（即氧化劑，又叫氫供體或電子受體）的酶。由于具有特殊的傳遞電子的性質(zhì)，氧化還原酶在有機合成、生物降解、生物燃料電池及生物傳感器等領域具有重要的應用價值。近年來，介孔材料對氧化還原酶的固定化也備受關注，已有多種氧化還原酶（如乙醇脫氫酶、單加氧酶、過氧化物酶、葡萄糖氧化酶（GOx）等）被成功地固載到介孔二氧化硅載體中［9］。Jung等［36］將GOx和氯過氧化物酶（CPO）共同固載在SBA-15和MCF介孔材料中，利用兩種酶催化的串聯(lián)反應來合成重要的藥物中間體2-吲哚酮，反應過程見圖5。

圖5 共固定化于介孔材料中的GOx和CPO催化串聯(lián)反應制備2-吲哚酮的過程［36］Fig.5 Oxidation of indole to 2-indolinone by cascade reaction using glucose oxidase(GOx) and chloroperoxidase(CPO) supported on mesoporous silica ［36］.

在該反應中，CPO為主酶，H2O2為氧化劑，催化吲哚轉化為2-吲哚酮。而該過程中所需的H2O2可通過GOx催化的葡萄糖氧化反應進行原位再生。采用共固定化兩種酶的方法，可有效地避免過量的H2O2對CPO的毒化作用，提高反應體系的催化效率和穩(wěn)定性。同時，在進行適當?shù)慕宦?lián)處理后，所得的共固定化酶的連續(xù)操作穩(wěn)定性明顯提高，可應用于固定床反應。

HRP也是一種常見的氧化還原酶，常被用于制備生物傳感器及催化一系列有機反應，如N-和O-去烷基化反應、氧化耦合反應、選擇性羥基化反應、氧原子轉移反應等。Chouyyok等［37］將HRP固載到幾種不同的介孔材料中，考察了體系的pH及載體的納米孔結構對固定化HRP催化鄰苯三酚氧化反應的影響。研究結果表明，固定化HRP在pH=8.0的體系中催化活性最適宜，且以MCF介孔材料為載體時，所得的固定化酶比以MCM-41和SBA-15介孔材料為載體時所得的固定化酶的穩(wěn)定性更高。Phuoc等［38］研究了HRP和GOx在介孔材料中的共固定化，并以4-氨基安替比林和苯酚的偶聯(lián)反應為模型反應，考察了HRP的催化性能（見圖6）。在HPR催化反應過程中所需的H2O2氧化劑可以用GOx催化的葡萄糖氧化反應進行原位再生。研究結果表明，當HPR和GOx被共同固載在介孔二氧化硅納米孔中后，兩種酶的穩(wěn)定性均得到明顯提高，且與單一酶催化體系的活性相比，HRP和GOx在串聯(lián)反應中的催化活性均沒有明顯下降。此外，他們還用血紅蛋白替代HRP，所得的共固定化酶可以用來催化工業(yè)廢水中常見的污染物多環(huán)芳烴（PAH）的氧化反應。他們發(fā)現(xiàn)以氧氣為催化劑，當血紅蛋白與GOx的摩爾比為1 000時，所得的共固定化酶可在常溫常壓下有效去除污水中的PAH（去除率為64%）。

圖6 共固定化在介孔二氧化硅中的GOx和HPR催化串聯(lián)反應氧化4-氨基安替比林的過程［38］Fig.6 Oxidation of 4-aminoantipyridine through cascade reaction using GOx and horseradish peroxidase(HPR) encapsulated in mesoporous silica［38］.

3 結語

酶的固定化能夠實現(xiàn)酶的重復使用和連續(xù)化生產(chǎn)，同時可以改善酶的催化活性、穩(wěn)定性和選擇性，是現(xiàn)代生物技術及其工業(yè)化環(huán)節(jié)中的一項重要內(nèi)容。氧化硅基有序介孔材料因其具有獨特的孔結構和易于有機修飾改性的特點，是固定化酶的理想載體。一系列研究結果表明，當酶分子被固載到介孔材料中后，載體的孔徑尺寸及納米孔內(nèi)的微環(huán)境會對固定化酶的活性和穩(wěn)定性產(chǎn)生直接影響。因此對介孔材料進行理性設計和可控制備是獲得具有高活性和高穩(wěn)定的固定化酶的重要途徑。利用聚合物大分子對介孔材料進行修飾有利于在納米孔內(nèi)模擬細胞中酶分子周圍微環(huán)境的性質(zhì)，從而提高固定化酶的催化性能，為解決生物催化劑工業(yè)應用瓶頸提供了一種新的手段。雖然目前有序介孔材料固定化酶的實際應用還較少，但其在生物柴油、生物質(zhì)轉化、手性藥物及精細化學品合成、生物傳感器、生物燃料電池、廢水處理等領域具有廣闊的應用前景。隨著研究的不斷深入，介孔材料固定化酶的使用將更加經(jīng)濟可行，表現(xiàn)出更多的傳統(tǒng)化學催化所不可比擬的優(yōu)越性。

［1］ Tao Junhua，Kazlauskas R J. Biocatalysis for Green Chemistry and Chemical Process Development［M］. Hoboken：John Wiley & Sons，Inc，2011.

［2］ Hartmann M，Jung D. Biocatalysis with Enzymes Immobilized on Mesoporous Hosts：The Status Quo and Future Trends［J］.J Mater Chem，2010，20（5）：844 - 857.

［3］ Cao Linqiu. Carrier-Bound Immobilized Enzymes：Principles，Applications and Design［M］. Weinheim：WILEY-VCH，2008.

［4］ Mateo C，Palomo J M，F(xiàn)ernandez-Lorente G，et al. Improvement of Enzyme Activity，Stability and Selectivity via Immobilization Techniques［J］.Enzyme Microb Technol，2007，40（6）：1451 - 1463.

［5］ Hudson S，Cooney J，Magner E. Proteins in Mesoporous Silicates［J］.Angew Chem，Int Ed，2008，47（45）：8582 - 8594.

［6］ Hanefeld U，Gardossi L，Magner E. Understanding Enzyme Immobilisation［J］.Chem Soc Rev，2009，38（2）：453 - 468.

［7］ Diaz J F，Balkus K J. Enzyme Immobilization in MCM-41 Molecular Sieve［J］.J Mol Catal B：Enzym，1996，2（2/3）：115 - 126.

［8］ Hartmann M，Xenia K. Immobilization of Enzymes on Porous Silicas-Bene fi ts and Challenges［J］.Chem Soc Rev，2013，42（15）：6277 - 6289.

［9］ Zhou Zhou，Hartmann M. Progress in Enzyme Immobilization in Ordered Mesoporous Materials and Related Applications［J］.Chem Soc Rev，2013，42（9）：3894 - 3912.

［10］ Lee Chia-Hung，Lin Tien-Sung，Mou Chung-Yuan. Mesoporous Materials for Encapsulating Enzymes［J］.Nano Today，2009，4（2）：165 - 179.

［11］ Takahashi H，Li Bo，Sasaki T，et al. Catalytic Activity in Organic Solvents and Stability of Immobilized Enzymes Depend on the Pore Size and Surface Characteristics of Mesoporous Silica［J］.Chem Mater，2000，12（11）：3301 - 3305.

［12］ Lykourinou V，Chen Yao，Vetromile C，et al. Immobilization of MP-11 into a Mesoporous Metal-Organic Framework，MP-11@mesoMOF：A New Platform for Enzymatic Catalysis［J］.J Am Chem Soc，2011，133（27）：10382 - 10385.

［13］ Liu Jia，Lan Guojun，Peng Juan，et al. Enzyme Con fi ned in Silica-Based Nanocages for Biocatalysis in a Pickering Emulsion［J］.Chem Commun，2013，49：9558 - 9560.

［14］ Ma Hui，He Jing，Evans D G，et al. Immobilization of Lipase in a Mesoporous Reactor Based on MCM-41［J］.J Mol Catal B：Enzym，2004，30（5/6）：209 - 217.

［15］ He Jing，Song Zhihong，Ma Hui，et al. Formation of a Mesoporous Bioreactor Based on SBA-15 and Porcine Pancreatic Lipase by Chemical Modification Following the Uptake of Enzymes［J］.J Mater Chem，2006，16（44）：4307 - 4315.

［16］ Homouz D，Stagg L，Wittung-Stafshede P，et al. Macromolecular Crowding Modulates Folding Mechanism of Alpha/Beta Protein Apo fl avodoxin［J］.Biophys J，2009，96（2）：671 -680.

［17］ Mukherjee S，Waegele M M，Chowdhury P，et al. Effect of Macromolecular Crowding on Protein Folding Dynamics at the Secondary Structure Level［J］.J Mol Biol，2009，393（1）：227 - 236.

［18］ Tanizaki S，Clifford J，Connelly B D，et al. Conformational Sampling of Peptides in Cellular Environments［J］.Biophys J，2008，94（3）：747 - 759.

［19］ Secundo F. Conformational Changes of Enzymes upon Immobilisation［J］.Chem Soc Rev，2013，42（15）：6250 - 6261.

［20］ Rodrigues R C，Ortiz C，Berenguer-Murcia A，et al. Modifying Enzyme Activity and Selectivity by Immobilization［J］.Chem Soc Rev，2013，42（15）：6290 - 6307.

［21］ Minton A P. The Effects of Volume Occupancy upon the Thermodynamic Activity of Proteins：Some Biochemcial Consequences［J］.Mol Cell Biochem，1983，55（2）：119 - 140.

［22］ Zimmerman S B，Miton A P. Macromolecular Crowding：Biochemical，Biophysical and Physiological Consequence［J］.Annu Rev Biophys Biomol Struct，1993，22：27 - 65.

［23］ Ping Guanghui，Yuan Jianmin，Sun Zhengfei，et al. Studies of Effects of Macromolecular Crowding and Con fi nement on Protein Folding and Protein Stability［J］.J Mol Recognit，2004，17（5）：433 - 440.

［24］ Liu Jia，Peng Juan，Shen Shuai，et al. Enzyme Entrapped in Polymer-Modified Nanopores：Macromolecular Crowding Effect［J］.Chem Eur J，2013，19（8）：2711 - 2719.

［25］ Park M，Park S S，Selvaraj M，et al. Hydrophobic Mesoporous Materials for Immobilization of Enzymes［J］.Microporous Mesoporous Mater，2009，124（1/3）：76 - 83.

［26］ Carrasco M S，Rad J C，Gonzalez-Carcedo S. Immobilization of Alkaline Phosphatase by Sorption on Na-Sepiolite［J］.Bioresour Technol，1995，51（2/3）：175 - 181.

［27］ Galarneau A，Mureseanu M，Atger S，et al. Immobilization of Lipase on Silicas：Relevance of Textural and Interfacial Properties on Activity and Selectivity［J］.New J Chem，2006，30（4）：562 - 571.

［28］ Liu Jia，Bai Shiyang，Jin Qianru，et al. Improved Catalytic Performance of Lipase Accommodated in the Mesoporous Silicas with Polymer-Modified Microenvironment［J］.Langmuir，2013，28（25）：9788 - 9796.

［29］ Liu Jia，Bai Shiyang，Jin Qianru，et al. Enhanced Thermostability of Enzymes Accommodated in Thermo-Responsive Nanopores［J］.Chem Sci，2013，3（12）：3398 - 3402.

［30］ Liese A，Hilterhaus L. Evaluation of Immobilized Enzymes for Industrial Applications［J］.Chem Soc Rev，2013，42（15）：6236 - 6249.

［31］ Chang R H，Jang J，Wu K C W. Cellulase Immobilized Mesoporous Silica Nanocatalysts for Ef fi cient Cellulose-to-Glucose Conversion［J］.Green Chem，2011，12（10）：2844 - 2850.

［32］ Salis A，Casula M F，Bhattacharyya M S，et al. Physical and Chemical Lipase Adsorption on SBA-15：Effect of Different Interactions on Enzyme Loading and Catalytic Performance［J］.ChemCatChem，2012，24（3）：322 - 329.

［33］ Itoh T，Nishimura Y，Ouchi N，et al. 1-Butyl-2，3-Dimethylimidazolium Tetrafluoroborate：The Most Desirable Ionic Liquid Solvent for Recycling Use of Enzyme in Lipase-Catalyzed Transesterification Using Vinyl Acetate as Acyl Donor［J］.J Mol Catal B：Enzym，2003，26（1/2）：41 - 45.

［34］ Itoh T，Ouchi N，Nishimura Y，et al. Novel Supporting Materials of Lipase PS Suitable for Use in an Ionic Liquid Solvent System［J］.Green Chem，2003，5（5）：494 - 496.

［35］ Zheng Liangyu，Zhang Suoqin，Zhao Lifang，et al. Resolution ofN-(2-Ethyl-6-Methylphenyl)Alanine via Free and Immobilized Lipase from Pseudomonas Cepacia［J］.J Mol Catal B：Enzym，2006，38（3）：119 - 125.

［36］ Jung D，Streb C，Hartmann M. Oxidation of Indole Using Chloroperoxidase and Glucose Oxidase Immobilized on SBA-15 as Tandem Biocatalyst［J］.Microporous Mesoporous Mater，2008，113（1/3）：523 - 529.

［37］ Chouyyok W，Panpranot J，Thanachayanant C，et al. Effects of pH and Pore Characters of Mesoporous Silicas on Horseradish Peroxidase Immobilization［J］.J Mol Catal B：Enzym，2009，56（4）：246 - 252.

［38］ Phuoc L T，Laveille P，Chamouleau F，et al. Phospholipid-Templated Silica Nanocapsules as Ef fi cient Polyenzymatic Biocatalysts［J］.Dalton Trans，2010，39（36）：8511 - 8520.

（編輯 李明輝）

Research Progress and Application Prospect of Enzyme Immobilization on Mesoporous Silica-Based Materials

Liu Jia1，2，Yang Qihua1
（1. Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian Liaoning 116023，China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering，University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100029，China）

This paper reviewed the current status of the development of enzyme immobilization on mesoporous silica-based materials，in particular with focus on the main factors(pore diameter and nanopore microenvironment) influencing the catalytic properties of enzymes immobilized in nanopores of mesoporous supports. The application prospect of the immobilized enzymes in biodiesel production，biomass conversion，synthesis of fi ne chemicals and chiral pharmaceuticals，fabrication of biofuel cells and biosensors was also discussed using hydrolase and oxidoreductase as model enzymes.

biocatalysis；mesoporous silica-based materials；enzyme immobilization

1000 - 8144（2014）04 - 0357 - 07

TQ 426.97

A

2013 - 09 - 10；［修改稿日期］2013 - 12 - 26。

劉佳（1986—），女，河南省新鄉(xiāng)市人，博士，電話0411 - 84379219，電郵 jialiu@dicp.ac.cn。聯(lián)系人：楊啟華，電話0411 - 84379552，電郵 yangqh@dicp.ac.cn。

國家自然科學基金資助項目（21273226）。

研究與開發(fā)