劉建一，辛剛

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶163319，2.佳木斯市質(zhì)量技術監(jiān)督局）

在世界能源嚴重危機的今天，生物質(zhì)能成為僅次于石油、天然氣和煤的第四種重要能源，它是通過綠色植物的光合作用，將太陽能轉化為有機物中，囤積在生物體內(nèi)的一種能量。中國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)生大量的秸稈等農(nóng)業(yè)廢物[1]，如何將這些生物質(zhì)能開發(fā)出來是目前我國科研領域的一大熱點[2-3]。在以往的微生物秸稈發(fā)酵研究中，通常研究純菌對秸稈類物質(zhì)降解的效果，這種方法沒有考慮到自然條件下微生物的協(xié)同關系，試驗從牛糞堆肥中篩選得到能夠降解秸稈產(chǎn)氫的菌系，并用生物方法對該菌系進行功能強化，提高菌系的秸稈降解率和產(chǎn)氫率。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

纖維素產(chǎn)氫復合菌系樣品來自佳木斯周邊牛糞堆肥。

1.2 秸稈來源

水稻秸稈從建三江農(nóng)場采集，將取到的秸稈洗凈，然后高溫將其烘干，剪成長度小于等于1 cm的秸稈段待用。

1.3 培養(yǎng)基配制

富集培養(yǎng)基：RFT培養(yǎng)基[4]。

秸稈培養(yǎng)基 （L-1）：NH4Cl 1.0 g，K2HPO41.5 g，K2HPO43.5 g，NaCl 1.0 g，MgCl20.5 g，KCl 0.2 g，酵母粉2.0 g，半胱氨酸0.5 g，秸稈5 g，蛋白胨2.0 g，維生素液[5]5 mL，微量元素溶液[5]1 mL，刃天青1.5mg，pH 7.0。

纖維二糖培養(yǎng)基：K2HPO43.5 g，NH4Cl 1.0 g，K2HPO41.5 g，MgCl20.5 g，半胱氨酸0.5 g，NaCl1.0 g，KCl 0.2 g，蛋白胨2.0 g，纖維二糖10 g，酵母粉2.0 g，維生素液[5]5 mL，微量元素溶液[5]1 mL，刃天青1.5mg，pH 8.5。

濾 紙 培 養(yǎng) 基 （L-1）：NH4Cl 1.0 g，1.5 g，MgCl2K2HPO43.5 g，K2HPO40.5g，NaCl 1.0 g，KCl 0.2 g，酵母粉2.0 g，半胱氨酸0.5 g，蛋白胨2.0 g，濾紙5 g，維生素液[5]5mL，微量元素溶液[5]1mL，刃天青1.5mg，pH 9.0。

如需配制固體培養(yǎng)基，即在原有的成分中另外添加20 g·L-1的瓊脂。

將各種培養(yǎng)基分裝于血清瓶內(nèi)，在培養(yǎng)基配制的全過程中用高純氮氣瓶，連接金屬細針吹脫去除血清瓶中的氧氣，在121℃條件下，高壓滅菌20min。

1.4 秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫菌系的富集與篩選

1.4.1 復合菌系的富集

分別稱取不同部位采集到的牛糞堆肥樣品10 g，裝入帶有數(shù)顆玻璃珠的無氧無菌水中，置于搖床中振蕩培養(yǎng)1 h，利用玻璃珠之間碰撞產(chǎn)生的剪切力將樣品分散開，使樣品中的微生物均勻暴露于液體中。再將所得混合體系接種于富集培養(yǎng)基中，接種量為10%，37℃靜止富集10 d，將混合體系轉接到秸稈培養(yǎng)基中，接種量為10%，37℃靜止富集10 d，連續(xù)轉接兩次，分別測定是否有氫氣產(chǎn)生，有氫氣產(chǎn)生即為纖維素產(chǎn)氫菌系。

1.4.2 連續(xù)稀釋轉接獲得高效產(chǎn)氫菌系

選取降解秸稈產(chǎn)氫效果較好的菌系，用無菌水將所得菌系進行梯度稀釋，取稀釋度為10-3～10-9的菌液分別接種到秸稈培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取樣利用氣相色譜測定（4890，Agilent）產(chǎn)氫效果，當測得產(chǎn)氫量升高，及時將菌系再次稀釋10-2～10-9倍，不斷重復此過程以得到高產(chǎn)氫復合菌系。

1.5 秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫純菌的分離與篩選

以纖維二糖為底物制作固體培養(yǎng)基，分別取5mL培養(yǎng)基注入?yún)捬豕苤校逃酶呒兊獨獯得?，高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降至50～60℃時，分別取菌液0.5、1.0、1.5、2.0mL，注入?yún)捬豕苤?，每濃度設置3組重復。采用改良的Hungate[6-7]厭氧滾管技術，將菌種均勻分布在厭氧管中，放于恒溫箱中，37℃倒置培養(yǎng)20 d，待菌落長出后，分別挑取單一菌落接種到厭氧濾紙液體培養(yǎng)基中，120 r·min-1培養(yǎng)，觀察濾紙的崩解情況，定期在顯微鏡下觀察菌種狀態(tài)，反復分離3～5次，待觀察到菌體形態(tài)一致即認為是純菌。

1.6 秸稈降解率測定方法

將發(fā)酵后的液體離心，收集剩余秸稈用蒸餾水沖洗，反復沖洗離心后，放于恒溫箱中，烘干待質(zhì)量不變化后測重。

秸稈降解率=（原始秸稈質(zhì)量-殘留秸稈質(zhì)量）/原始秸稈質(zhì)量×100%。

1.7 原子力顯微鏡觀察

將培養(yǎng)得到的新鮮菌體培養(yǎng)液進行梯度稀釋后，吸取10～15μL的懸浮液置于無菌載玻片上，將菌體固定10 min后，利用原子力顯微鏡（DI BioScope，Veeco）成像觀察。

1.8 產(chǎn)氫菌系的生物學特性

將分離的純菌在光學顯微鏡下觀察。

1.9 菌系生物強化效果研究

準備若干瓶新鮮的培養(yǎng)基，分別向培養(yǎng)基中接種比例為10%的菌系CYY，將這些菌系分別培養(yǎng)到5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 h待用，培養(yǎng)菌株CYY-9，待其處于生長對數(shù)期時使用。將處于對數(shù)時期的菌株CYY-9分別接種到已經(jīng)培養(yǎng)的菌系CYY培養(yǎng)基中，接種量分別為1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%。混合培養(yǎng)24 h后，按時測定不同組合的總產(chǎn)氫量（mL·L-1culture），每組做三個重復，取平均值。

2 結果與分析

2.1 秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫菌系的富集篩選

富集得到能在秸稈培養(yǎng)基中生長，并具有較好的產(chǎn)氫效果的菌系。將該菌系梯度稀釋后接種于新鮮培養(yǎng)基中，每24 h測定氫含量，當氫含量上升時，說明此時菌系中利用秸稈產(chǎn)氫的微生物活性強，反復將其稀釋轉接，從而得到產(chǎn)氫含量較高的菌系CYY。

2.2 產(chǎn)氫菌系的生物學特性

2.2.1 菌體的形態(tài)及生長曲線

圖1為顯微鏡（油鏡）下菌系形態(tài)圖，圖中有長短不一的桿狀菌，吸附在秸稈周圍。由菌體的生長曲線可見，菌株CYY在培養(yǎng)16到60 h時處于對數(shù)期，當培養(yǎng)到55 h，菌體的生長趨于平緩，說明達到穩(wěn)定期，故應該選擇培養(yǎng)40 h到55 h的菌體進行接種。60 h以后菌體的生長開始下降，此時菌體間爭奪營養(yǎng)，同時可能某些菌體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對菌系的生長起到抑制作用。

圖1 菌系CYY吸附秸稈效果圖Fig.1 Strains of CYY adsorption straw renderings

圖2 菌圖體3 菌生體長生量長量隨隨培時養(yǎng)間變時化間曲變線化曲線Fig.2 The cave of strain growth with time

圖3 不圖同4 溫不同度溫下度菌下菌體體的的生生長長情情況況Fig.2 The state of strains in different temputure

圖4 不同pH條件下菌體生長情況Fig.4 The state of strains growth in different pH

2.2.2 菌系生長的最適溫度

將菌株CYY在溫度分別為25、30、35、40、45、50、55、60℃的條件下恒溫培養(yǎng)后，分別測定OD值，得到圖3所示的結果，該菌能在25～60℃的溫度范圍內(nèi)生長，當環(huán)境溫度較低時，不適于菌體的繁殖，當溫度達到37℃時，菌體的生長量最大。當溫度高于最適生長溫度時，由于高溫使菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)逐漸失活，導致菌體的狀態(tài)量下降。

2.2.3 菌株生長的最適pH值

將菌株分別轉接到pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)3 d，測定菌的生長量，得到結果如圖4，該菌體在酸性條件下可以生長，但是生長量很低，當pH為8.5時，菌體的生長量達到最大值1.37，同時當pH在9左右也有較高的生物量，該菌的性質(zhì)滿足作洗滌劑的條件，該研究為該菌系在洗滌劑方面的應用研究奠定了基礎。

2.3 菌系的產(chǎn)氫效果

在37℃，pH為8.5的條件下，對菌體連續(xù)傳代17次，菌系產(chǎn)氫趨于穩(wěn)定，氫氣產(chǎn)量為90 mL·L-1culture，氫氣含量為13.4%，秸稈降解率為39.3%。

2.4 秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫純菌的篩選結果

將菌系CYY培養(yǎng)到對數(shù)期后，立即進行10-1梯度稀釋，采用改良的Hungate厭氧滾管技術，反復對菌體進行分純，經(jīng)多次純化后，觀察到厭氧管上菌落形態(tài)一致，認定為純菌。將得到的單菌落分別接種到新鮮培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，分離得到5株細菌，分別用CYY-9、CYY-11、CYY-12、CYY-14、CYY-15命名。

將所得菌株接種于秸稈培養(yǎng)基，進行靜態(tài)產(chǎn)氫實驗，幾株菌均可以對分解濾紙，其中CYY-9和CYY-11兩株菌崩解濾紙效果最好。比較各菌產(chǎn)氫效果，結果見表1。由表中數(shù)據(jù)可知，菌株CYY-9有較好的產(chǎn)氫效果，選擇CYY-9作為后續(xù)研究對象。

表1 各菌株產(chǎn)氫效果比較Table1 The effetof producetion hydrogen by strain separated

2.5 菌株CYY-9形態(tài)及生長特性

利用原子力顯微鏡觀察，如圖5，菌株CYY-9為桿狀菌，周邊無鞭毛，菌體表面光滑。此菌的最適生長溫度為37℃，最適生長pH值為8.5。菌株CYY-9在固體培養(yǎng)基中菌落表面光滑均勻，呈白色，不透明。

圖5 菌株CYY-9形態(tài)圖Fig.5 The characterization of strain JYB-13 under AFM

2.6 菌系生物強化效果

將菌株CYY-9接種到菌系中的最初一段時間內(nèi)，各試驗組中樣品的產(chǎn)氫能力均表現(xiàn)出下降趨勢，有些組甚至出現(xiàn)不產(chǎn)氫的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能是由于菌系內(nèi)部各菌株長期適應性的結果，個菌體在菌系中比例穩(wěn)定，數(shù)量和功能相互協(xié)調(diào)，當有外來菌株侵入時，導致菌系內(nèi)部的組成結構變化，菌系內(nèi)各菌需適應新的環(huán)境，所以導致產(chǎn)氫能力呈暫時下降趨勢。由表2可知，當菌系培養(yǎng)到40 h左右，接種菌株CYY-9，接種量為4%時，復合菌系的產(chǎn)氫能力最強，產(chǎn)氫量達到103 mL·L-1culture，在菌系培養(yǎng)初期添加菌株CYY-9時，此時接種量較低，兩部分菌株暫時可以同時生長，產(chǎn)氫結果與未添加CYY-9時的菌系相差不多。隨著樣品的培養(yǎng)時間延長，當菌系生長達到對數(shù)期時，菌系內(nèi)部結構和功能越來越穩(wěn)定，適應能力增強，此時接種較少的菌株CYY-9，復合菌系中的各菌共同生長，菌系中各種產(chǎn)氫菌能力均能得到極大地發(fā)揮。當菌系生長到穩(wěn)定期以后再接種菌株CYY-9，效果較差，此時菌系生長能力穩(wěn)定，甚至逐漸出現(xiàn)衰退，菌種產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物可能對新填入的品種產(chǎn)生毒害作用，各部分的產(chǎn)氫能力很難發(fā)揮出來。

表2 不同復配條件菌系產(chǎn)氫量/m L·L-1 cultureTable2 The componentof straw under defferent disposing/mL·L-1 culture

3 結論

實驗從牛糞堆肥中篩選出一個能降解秸稈，有較好產(chǎn)氫效果的菌系CYY，菌系生長的最適溫度是37℃，最適生長pH為8.5，在秸稈培養(yǎng)基中，氫氣產(chǎn)量為90mL·L-1culture，氫氣含量達到13.4%，稈降解率為39.3%。

利用改良的Hungate厭氧滾管法，在菌系CYY中篩選得到一株能夠較好的降解秸稈產(chǎn)氫的菌株CYY-9，此菌形態(tài)為桿狀，最適生長溫度為37℃，最適生長pH值為8.5。

將菌系CYY培養(yǎng)到40 h左右，將菌株CYY-9以一定比例接種到菌系中，測定得到當菌株CYY-9接種量為4%時，復合菌系的產(chǎn)氫能力最強，產(chǎn)氫量達到103mL·L-1culture，增長率為12.9%，秸稈降解率達49.2%，增長率為25.5%，達到對菌系CYY產(chǎn)氫能力強化的目的。

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