檀大羨 莫毅 陳自洪等

【摘要】目的：探討非梗阻性無精子癥患者睪丸生精細(xì)胞體外培養(yǎng)后的受精能力。方法：選取8例非梗阻性無精子癥患者的睪丸組織制備成生精細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后得到長形精子細(xì)胞顯微注射到卵細(xì)胞內(nèi)，觀察其受精情況。結(jié)果：8例患者睪丸生精細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后均有不同程度的分化、成熟。將培養(yǎng)后接近成熟的精子細(xì)胞通過顯微注射到卵細(xì)胞內(nèi)，卵細(xì)胞受精率為4.52%，熒光原位雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示卵細(xì)胞有受精。結(jié)論：非梗阻性無精子癥患者睪丸生精細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后有潛在的受精能力。

【關(guān)鍵詞】無精子癥；生精細(xì)胞；體外培養(yǎng)；顯微受精；熒光原位雜交

自20世紀(jì)90年代以來，睪丸生精細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)已有一定程度的進(jìn)展，可將人類睪丸生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)到接近成熟[1]，但未見對培養(yǎng)后其受精能力的報(bào)道。現(xiàn)對人類非梗阻性無精子癥患者的睪丸生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)，將培養(yǎng)后接近成熟的精子細(xì)胞通過顯微注射到卵細(xì)胞內(nèi)后觀其受精情況，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1對象

選取經(jīng)睪丸病理活檢確診為非梗阻性無精子癥患者8例，年齡23～36歲；第二性征（胡須、喉結(jié)、陰毛生長）發(fā)育良好2例，發(fā)育不良6例；睪丸5～10mL，平均（7.56±2.25）mL，血清卵泡刺激素（FSH） 13.25～32.49IU/L，平均（21.35±9.62） IU/L；血清黃體生成素（LH） 7.56～16.58IU/L，平均（12.52±3.47） IU/L。

1.2主要儀器、試劑

顯微注射操作儀（Olympus）、熒光原位雜交儀（Thermabrite）和細(xì)胞培養(yǎng)基（Sigma）、胰蛋白酶溶液（上海）、EDTA溶液（武漢）、膠原酶溶液（上海）、CO2培養(yǎng)箱。

1.3方法

1.3.1睪丸組織的獲取8例非梗阻性無精子癥患者的睪丸組織通過睪丸活檢獲得，組織置于HTF中送回實(shí)驗(yàn)室。按本室建立的方法[2]獲取睪丸生精細(xì)胞和支持細(xì)胞。

1.3.2生精細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法睪丸組織分離后按本實(shí)驗(yàn)室建立的方法培養(yǎng)[3]。

1.3.3卵胞漿內(nèi)精子細(xì)胞顯微注射在顯微鏡下選擇培養(yǎng)了5d后獲得的長形精子細(xì)胞，采用顯微注射技術(shù)將長形精子細(xì)胞注入卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，置于HTF1026培養(yǎng)液的微滴中在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4熒光原位雜交試驗(yàn)使用雙色DNA熒光標(biāo)記探針（CEP X、Y）分別對未受精卵和ICSI后的受精卵進(jìn)行原位雜交分析，具體操作參照文獻(xiàn)[4]。樣品逐枚滴于多聚賴氨酸防脫玻片上，并對相應(yīng)位置進(jìn)行標(biāo)記，便于探針雜交及熒光分析。玻片經(jīng)洗滌、低滲、固定處理后，使用含2.5 mmol/L DTT的 1×PBS處理20 min使染色體去凝集，2×SSC洗滌和乙醇脫水風(fēng)干，60℃烤箱中烤片2.5h，染色體和探針變性雜交、洗脫、DAPI復(fù)染。使用熒光顯微鏡的WU、WIG和WIB濾光片分別觀察樣品內(nèi)的熒光信號，并進(jìn)行攝像及記錄分析。熒光信號判定：綠色熒光信號為X染色體，紅色熒光信號為Y染色體。

2結(jié)果

2.1生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的結(jié)果

本研究中，睪丸組織經(jīng)酶消化后在顯微鏡下可觀察到未成熟的生精細(xì)胞，包括有精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞以及支持細(xì)胞。這些未成熟的生精細(xì)胞培養(yǎng)后第2至3d，在倒置顯微鏡下可見有圓形精子細(xì)胞出現(xiàn)，第5d后，見有長形精子細(xì)胞出現(xiàn)，經(jīng)計(jì)數(shù)初級精母細(xì)胞分化為精子細(xì)胞的分化率約3.35%。

2.2卵胞漿內(nèi)精子細(xì)胞顯微注射后的結(jié)果

選擇培養(yǎng)獲得的長形精子細(xì)胞，分別注射到47個(gè)MⅡ期的卵母細(xì)胞胞漿中，其中觀察到有2個(gè)卵母細(xì)胞出現(xiàn)2個(gè)雌雄原核和2個(gè)極體，受精率為4.26%。

2.3熒光原位雜交分析結(jié)果

經(jīng)熒光原位雜交分析，觀察未受精卵5個(gè)，在熒光激發(fā)后只觀察到1個(gè)綠色熒光標(biāo)記，說明只存在X染色體而無Y染色體；觀察出現(xiàn)受精的兩個(gè)受精卵，其中1枚顯微注射后受精卵內(nèi)含有2個(gè)綠色熒光標(biāo)記，另一枚顯微注射后受精卵內(nèi)含有1個(gè)綠色熒光和1個(gè)紅色熒光標(biāo)記，熒光原位雜交分析結(jié)果表明兩個(gè)卵細(xì)胞已經(jīng)受精。

3討論

人類生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)后能獲得進(jìn)一步的分化和成熟。Hasegawa等已能將初級精母細(xì)胞培養(yǎng)到精子細(xì)胞階段，精子細(xì)胞能進(jìn)一步變形成長形精子細(xì)胞[5-7]，有些精子細(xì)胞出現(xiàn)鞭毛，直至獲得成熟的精子[8]。本研究中，生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)后可從初級精母細(xì)胞分化到精子細(xì)胞分階段，分化率約3.35%，而且精子細(xì)胞可變形為長形精子細(xì)胞，這一研究結(jié)果與國外研究相比較，其分化率仍較低，雖然比本室以往的結(jié)果[3]有所提高，但仍有待進(jìn)一步改善培養(yǎng)技術(shù)，以獲得更好的結(jié)果。

隨著生精細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)和生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們已能進(jìn)行卵胞質(zhì)內(nèi)圓形精子細(xì)胞注射術(shù)（round spermatid injection， ROSI）和卵胞質(zhì)內(nèi)長形精子細(xì)胞注射術(shù)（elongate spermatid injection， ELSI）[9]。Tesarik等[10]于1996年報(bào)道了ROSI第一例嬰兒出生，隨后，他們將培養(yǎng)后變形的長形精子細(xì)胞通過ELSI技術(shù)使患者的配偶獲妊娠成功，產(chǎn)下發(fā)育正常的雙胞胎嬰兒。Sousa等[11]將接近成熟的長形精子細(xì)胞ELSI，卵母細(xì)胞的受精率約為31%～38%，且有囊胚形成。本研究將培養(yǎng)后獲得的47個(gè)長形精子細(xì)胞注射入卵母細(xì)胞內(nèi)，有2個(gè)受精，而且已經(jīng)FISH檢測證實(shí)，其受精率為4.26%。但是，我們依然看到，ROSI與ELSI技術(shù)的效果與采用成熟成活的精子的ICSI相比仍較低，本研究的受精率僅為4.26%，表明這一技術(shù)有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-10-15）