賈圓圓 馮建軍 關(guān)瑞章

摘要 噬菌體抗體庫技術(shù)是將目的基因克隆到噬菌體的外殼蛋白基因組中，轉(zhuǎn)染宿主菌后，使目的基因編碼蛋白和外殼蛋白以融合蛋白的形式表達，呈現(xiàn)在噬菌體表面，通過一系列的篩選獲得特異性噬菌體抗體分子。介紹了噬菌體抗體庫技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的疾病防控、水環(huán)境監(jiān)測、水產(chǎn)品安全控制以及與抗體芯片結(jié)合研究等方面的研究進展。

關(guān)鍵詞 噬菌體抗體庫;水產(chǎn)養(yǎng)殖;研究進展

中圖分類號 S941 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11740-03

Research Progress of Phage Antibody Library Technology in Aquaculture

JIA Yuan-yuan， FENG Jian-jun*， GUAN Rui-zhang

（Eel Modern Industry Technology Engineering Research Center of Ministry Education， Key Lab of East China Sea Water Healthy Aquaculture of Ministry of Agriculture， Fishery College， Jimei University， Xiamen， Fujian 361061）

Abstract Target gene are displayed on the surface of filamentous bacteriophage by genetic fusion to a coat protein of phage is the basic principle of phage antibody library technology. The most characteristic of it is a direct physical link from genotype to phenotype and the specific antibody of the Phage could be obtained by screening of enrichment. In this paper， recent research progress on disease control， water environment monitoring， aquatic products safety control， and combination with the antibody microarray in the aquaculture industry has been reviewed.

Key words Phage antibody library; Aquaculture; Research progress

基金項目 福建省海洋與漁業(yè)廳項目（201212140006）;福建省教育廳項目（JA11150）;集美大學(xué)創(chuàng)新團隊基金項目（2010A001）。

作者簡介 賈圓圓（1990- ），女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：魚類疾病防控。

*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事魚類疾病防控研究。

收稿日期 2014-10-11

抗體庫（Antibody library）技術(shù)主要是通過PCR技術(shù)克隆全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，重組、構(gòu)建到特定的表達載體中，在原核或真核生物體內(nèi)表達出具有生物學(xué)功能的抗體分子，并通過親和篩選獲得特異性抗體[1]。噬菌體抗體庫（Phage antibody library）技術(shù)是迄今為止發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的制備抗體的技術(shù)，它是一種將PCR技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合，并在噬菌體表面表達、分泌，經(jīng)過篩選后獲得特異性抗體的技術(shù)[2]。噬菌體抗體庫技術(shù)的基本原理是將外源DNA片段插入噬菌體編碼蛋白基因中，使外源DNA片段的表達產(chǎn)物與噬菌體的外殼蛋白融合，展示于噬菌體表面[3]，具有操作簡單、低成本以及技術(shù)成熟等特點，在商業(yè)生產(chǎn)中被成功應(yīng)用[4]。目前，噬菌體抗體庫分為Fv、Fab、單鏈抗體（Single-chain antibody fragment）、單區(qū)抗體（Single domain antibody）和雙鏈抗體（Diabody）等類型。單鏈抗體主要通過15個氨基酸序列（Gly4Ser）3 linker將重鏈和輕鏈連接起來，具有體積小、免疫原性低的特點，不易引起人體或動物排斥反應(yīng)。因其無抗體Fc段，不易與具有Fc受體的非靶細胞結(jié)合，由于片段分子量較低，能夠有效穿透致密的組織屏障達到病灶部位，在醫(yī)療診斷和疾病治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，成為現(xiàn)代生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點，被認為是21世紀的陽光產(chǎn)業(yè)[5-7]。

近年來，噬菌體抗體庫技術(shù)已逐步應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，在養(yǎng)殖病害防治、藥物殘留檢測、水體水質(zhì)監(jiān)測以及食品安全控制等方面已經(jīng)有不少報道。另外，也有學(xué)者將抗體庫技術(shù)與抗體芯片結(jié)合對多種水體病原菌進行高通量檢測，為抗體庫在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。

1 噬菌體抗體庫在水產(chǎn)病害防控中的研究

1.1 細菌性疾病的防治

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)品年總量約占世界總量的70%。由于環(huán)境的污染及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)本身的高密度、集約化生產(chǎn)，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害時有發(fā)生，每年造成近百億元的經(jīng)濟損失，其中細菌性疾病造成的危害和損失尤為嚴重[8]。

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種食源性的病源微生物，廣泛存在于浮游生物及海產(chǎn)品中，不僅能夠引發(fā)海產(chǎn)品的敗血癥，還會導(dǎo)致人的食物性中毒，引起惡心、嘔吐和腹瀉等腸胃炎疾病[9]。目前對于副溶血弧菌的致病機理尚不清楚，缺乏有效的預(yù)防與治療手段。三型分泌系統(tǒng)（T3SS）是已知副溶血弧菌致病的主要因子之一[10]，而T3SS毒力因子的運輸管道Needle在其致病過程中起著決定性作用[11]。方遂等[12]通過Overlap-PCR將VH、Linker和VL組裝成完整的scFv基因，同時將scFv基因克隆到噬菌體載體pCANTAB-5E上，成功構(gòu)建了噬菌體單鏈抗體文庫，測得該文庫庫容量約為1.4×107 cfu/ml。經(jīng)過富集、淘洗得到2株驗證無誤的單鏈抗體，經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)2株菌株可視為1株單鏈抗體，ELISA檢測結(jié)果表明所篩選的單鏈抗體具有較高的抗體特異性。由于副溶血弧菌具有多個治病因子，將篩選到的單鏈抗體與副溶血弧菌的其他致病因子抗體結(jié)合，可制備多功能抗體，控制和治療副溶血弧菌的發(fā)生和擴散。

鰻弧菌（Vibrio anguillarum）是海水魚及淡水魚中的重要致病菌，可以感染虹鱒、鰻鱺、鱸魚、黃魚、石斑魚等幾十種魚類，致死率較高，在我國十分流行。夏永娟等[13]成功構(gòu)建了抗鰻弧菌獨特型單克隆抗體dsFv基因，并使其準確的在M13噬菌體表面獲得了呈現(xiàn)。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)抗鰻弧菌獨特型dsFv噬菌體能夠與抗原特異性結(jié)合，抗獨特型抗體能夠模擬抗原表位，可以作為疫苗使用[14-15]，而抗鰻弧菌獨特型dsFv噬菌體可以通過細菌繁殖大量獲得，降低了疫苗的成本。該dsFv噬菌體有望成為用于預(yù)防魚類鰻弧菌感染的新一代基因工程疫苗。

1.2 病毒性疾病的防治

草魚呼腸孤病毒（Reovirus of grass carp，GCRV）是我國分離的第1株魚類病毒[16-17]，是引起我國草魚幼魚出血病大面積暴發(fā)的主要病原體，這種疾病一旦爆發(fā)，其死亡率可高達85%[18]。陳叢琳等[19]從已構(gòu)建的小鼠天然噬菌體展示抗體文庫中淘選并獲得了可以特異性識別草魚IgM的單鏈抗體，并在已鑒定的單鏈抗體陽性克隆中，篩選出對草魚IgM 有較好的特異性結(jié)合的單鏈抗體C1B3。結(jié)果表明，相對于病毒的其他結(jié)構(gòu)蛋白而言，VP7在草魚中能產(chǎn)生更強的免疫反應(yīng)，由此推導(dǎo)VP7 應(yīng)是用于疫苗設(shè)計的首選抗原。該研究通過單鏈抗體，為草魚呼腸孤病毒及其他魚類病原體重組疫苗的研發(fā)提供了重要的分析手段和策略。張曉華等[20]利用實驗室構(gòu)建的大容量天然噬菌體展示單鏈抗體文庫成功獲取了能夠識別GCRV VP7 的單鏈抗體，此抗體將成為后面進一步研究病毒與細胞相互作用的有效工具。

對蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）為已知基因組最大的動物病毒[21]，嚴重危害水生甲殼動物養(yǎng)殖業(yè)。王曉潔等[22]從抗WSSV單抗的細胞株中，采用間接熒光檢測法篩選出8株分泌較強的抗WSSV單抗的細胞株，可用于白斑綜合癥病毒快速檢測試劑盒的研制。試驗采用雙抗夾心免疫層析法，制成快速檢測、診斷WSSV的試紙條，整個反應(yīng)只需5 min，與以前檢測WSSV較快的斑點免疫印跡法需要3 h相比，在很大程度上提高了檢測速度。白斑綜合癥病毒檢測試紙條是一種快速、簡便、準確、適合于現(xiàn)場使用的WSSV檢測、診斷試紙條，且無假陽性。此試紙條尤其適于養(yǎng)殖人員現(xiàn)場、時事跟蹤、監(jiān)控、檢測，可為白斑癥的預(yù)防提供可靠的監(jiān)測依據(jù)。

2 噬菌體抗體庫在水環(huán)境監(jiān)控的研究

2.1 藥物殘留檢測

目前，用化學(xué)藥物和抗生素治療魚類細菌性疾病是常用且較為有效的方法，但同時具有很多弊端，如藥物和抗生素在水產(chǎn)品中的殘留、病原生物耐藥性增強、水域生態(tài)污染等。在尋求病害防治的其他方法時，傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)獲得的抗體不僅費時費力，而且制備過程較為復(fù)雜，無法滿足高通量的需要，噬菌體抗體庫技術(shù)獲得的抗體具有簡單、快速、高通量的優(yōu)點。

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）為化學(xué)合成抗菌藥，由于其具有廣譜抗菌活性，且價格低廉，應(yīng)用廣泛，在醫(yī)學(xué)和動物的感染性疾病防治中具有重要地位，但不合理的使用容易引起過敏反應(yīng)[23]，造成耐藥菌增加，且動物性食品中殘留的藥物可能對人們的健康造成潛在的危害[24]。趙琳等[25]成功構(gòu)建斑點叉尾鮰天然Fab噬菌體抗體庫，最終得到的庫容量約為5.67×107 cfu/ml。在此抗體庫的基礎(chǔ)上，閆曉敏等[26]以偶聯(lián)卵血清蛋白的磺胺甲氧嗦（OVA-SMP）和磺胺甲惡哇（OVA-SMZ）為固相包被抗原，篩選并獲得了特異性較強的Fab抗體。王輝等[27]成功建立了斑點叉尾蛔單鏈抗體（ScFv）抗體庫，并測定其庫容為5.8×105 cfu/ml。以O(shè)VA-SMZ為包被抗原，篩選到針對OVA-SMZ的抗體。

2.2 水質(zhì)監(jiān)測

在養(yǎng)殖過程中，投入過量的營養(yǎng)物質(zhì)、大量施肥和投餌等可導(dǎo)致水體中的氮、磷超標，從而引起藻類和浮游生物過度繁殖，嚴重影響?zhàn)B殖的成活率。微囊藻素是從藍藻水華中分離出來的多肽毒素，能夠強烈抑制蛋白磷酸酶的活性，對水產(chǎn)養(yǎng)殖和水體環(huán)境的危害比較嚴重。已有大量文獻報道微囊毒素對魚類的危害，微囊毒素主要危害魚類鰓、肝、腎、消化器官、循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等[28]。Zhao等[29]利用噬菌體抗體庫技術(shù)以微囊藻毒素為包被抗原，從構(gòu)建的噬菌體抗體庫中成功篩選到特異性目標抗體，得到的目標抗體可以快速簡單地對水體中微囊藻素進行監(jiān)測，在水體水質(zhì)檢測上具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 噬菌體抗體庫在水產(chǎn)品安全控制的研究

長久以來，河豚魚被認為是東亞以及東南亞居民餐桌上一道美味的魚類食物，但由于河豚毒素有劇毒，因此每年都會發(fā)生30～50例河豚魚中毒的事件[30]。河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是河豚魚中最主要的一種毒素成分。劉立才等[31]成功構(gòu)建抗河豚毒素（TTX）的重組的單鏈抗體（scFv）展示文庫，庫容量為 1.5×106 cfu/ml，經(jīng)過6輪的淘選過程，獲得了與河豚毒素特異性結(jié)合的抗體，該抗體庫的構(gòu)建為快速檢測河豚毒素提供了基礎(chǔ)。

在熱帶和亞熱帶海域珊瑚礁的附近，有400多種魚因食用毒藻類而被毒化，其中包括梭魚、黑鱸和真鯛等重要海洋經(jīng)濟魚類，這些魚類統(tǒng)稱為雪卡魚。這些雪卡魚體內(nèi)都含有雪卡毒素，是一種可引起人類中毒的珊瑚魚毒素，毒性極強，比河豚毒素的毒性強20倍[32]。雪卡毒素主要存在于肌肉、內(nèi)臟和生殖腺中，可引發(fā)神經(jīng)性中毒。Nagumo等[33]通過噬菌體抗體庫技術(shù)成功篩選出抗雪卡魚毒素的特異性抗體，為今后雪卡魚毒素的研究及其檢測奠定了基礎(chǔ)。

4 噬菌體抗體庫與抗體芯片結(jié)合的研究

抗體芯片（Antibody microarrays）是一種特殊的蛋白質(zhì)芯片，又稱抗體微陣列，具有高特異性、高靈敏性、高通量及多樣品或多指標平行分析的優(yōu)點，是免疫學(xué)研究的一種新技術(shù)，已被應(yīng)用到許多領(lǐng)域[34]。王欣欣等[35]用抗體芯片成功的對海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella bacterium）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、海洋分支桿菌（Nontuberculoaus mycobacteria）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、海洋分支桿菌（Nontuberculoaus mycobacteria）等6種細菌進行了準確檢測。在此試驗中，應(yīng)用硫酸銨分級沉淀法進行兔抗血清的純化，這能有效去除免疫血清中的非特異性抗體和雜蛋白，降低兔抗血清的非特異性吸附，從而使其與其他菌株的交叉反應(yīng)降到最低。通過ELISA對6種細菌與各菌株兔抗血清之間的交叉反應(yīng)，分析發(fā)現(xiàn)純化后交叉反應(yīng)明顯減小，用吸附純化后的抗體構(gòu)建的病原菌檢測抗體芯片的特異性顯著增強，因此可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的準確檢測。廖瑋等[36]利用pⅧ展示系統(tǒng)成功改進噬菌體抗體芯片，由于pⅧ N端有多個帶電氨基酸，會增加非特異性吸附，這些帶電氨基酸會被陽性噬菌體上的融合抗體分子屏蔽，減少對蛋白質(zhì)的吸附，從而降低了背景。降低pⅧ的非特異吸附，不僅可以提高芯片的靈敏度，而且可以降低非特異結(jié)合的背景，提高淘選效率，大幅度提高了噬菌體抗體芯片的靈敏度和信噪比，同時可為抗體庫在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新途徑。

5 展望

綜上所述，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，噬菌體抗體庫技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景，已成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等問題的重要手段。同時隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的日益發(fā)展，噬菌體抗體庫技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用也具有廣闊的前景。但是，由于抗體庫技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域上的應(yīng)用處于初步發(fā)展階段，因此需要投入大量的人力和物力來開拓、優(yōu)化可用的抗體庫?？傊贵w庫技術(shù)作為一項新興的技術(shù)，必將在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的基礎(chǔ)研究及其實際應(yīng)用上產(chǎn)生深遠的影響。

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