賈玲華 寧喜斌

摘要 溶藻弧菌是一種海洋和海洋生物中普遍存在的致病菌，能夠感染人類和多種水產(chǎn)品。細(xì)菌粘附在介質(zhì)表面，分泌胞外基質(zhì)將自身包裹其中從而形成生物膜，具有極高的抗藥性和免疫逃逸能力，人類許多細(xì)菌感染均與生物膜有關(guān)。就溶藻弧菌生物膜進(jìn)行綜述，為相關(guān)研究提供理論參考。

關(guān)鍵詞 溶藻弧菌;生物膜;耐藥;抑制

中圖分類號 S986.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11866-03

Research Progress on Vibrio alginolyticus Biofilm

JIA Ling-hua， NING Xi-bin*

（Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract Vibrio alginolyticus， a ubiquitous pathogenic bacteria in marine and marine organism， can infect human beings and aquatic products. Bacteria that attach to surfaces aggregate in a hydrated polymeric matrix of their own synthesis to form biofilms， which have a very high resistance and immune escape capability. And there are many bacterial infections on human are biofilm related. This paper reviewes the research progress on Vibrio alginolyticus biofilms， and provides theoretical reference for related research.

Key words Vibrio alginolyticus; Biofilm; Antibiotic resistance; Inhibition

基金項目 上海市科委工程中心建設(shè)項目（11DZ2280300）;上海市精品課程資助項目。

作者簡介 賈玲華（1991- ），女，陜西寶雞人，碩士研究生，研究方向：食品安全。*通訊作者，教授，博士，從事食品安全、微生物學(xué)研究。

收稿日期 2014-10-15

生物膜是細(xì)菌在自然界中存在的主要形式之一。大量的研究證實，幾乎所有的細(xì)菌在特定條件下均能夠形成生物膜，這是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境維持自身生命所發(fā)生的變化，能夠增強(qiáng)細(xì)菌對外界環(huán)境的抵抗力[1]，生物膜的形成也被認(rèn)為是引起食品工業(yè)環(huán)境中細(xì)菌持續(xù)感染的一個主要原因[2-4]。

與副溶血性弧菌相似，溶藻弧菌是沿海地區(qū)食物中常見的、引發(fā)腹瀉病的致病菌[5-8]，是導(dǎo)致人類、水生動物細(xì)菌性疾病的重要致病菌之一[9]。據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，65%的人類細(xì)菌性感染都與生物膜的形成有關(guān)。溶藻弧菌生物膜（Biofilm，BF）能使內(nèi)部細(xì)菌抵御噬菌體、抗生素、殺菌劑和機(jī)體免疫系統(tǒng)等，造成免疫逃避，在臨床上引起慢性、持續(xù)感染和多重耐藥性[10]。

近年內(nèi)，我國研究人員對很多細(xì)菌如銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等形成的生物膜已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，然而溶藻弧菌的生物膜相關(guān)研究報道還是較少。因此，研究溶藻弧菌的生物膜對于人們的食品安全、自身健康以及社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展是十分必要的。筆者就溶藻弧菌生物膜進(jìn)行綜述，為相關(guān)研究提供理論參考。

1 生物膜的定義與結(jié)構(gòu)

細(xì)菌生物膜也稱作生物被膜，是指細(xì)菌粘附于惰性或活性物體表面，在代謝過程中會分泌胞外基質(zhì)（如多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等），并以特定方式將細(xì)菌自身包裹其中而組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落[11-12]。其形成是細(xì)菌細(xì)胞在長期生長過程中為抵抗不利環(huán)境，營造適宜生存環(huán)境而形成的一種與浮游菌迥然不同的生存方式。相較于浮游菌，形成生物膜后的細(xì)菌更容易在一些極端的環(huán)境下生存。

生物膜的相關(guān)概念最先是在1978 年由Costerton 等[13]提出的，然而，細(xì)菌生物膜的存在早在 1676 年Leeuwenhoek就已經(jīng)從自己的牙菌斑中觀察到了[14]，但當(dāng)時沒有引起人們的關(guān)注。直到Costerton 等在1987年報道了細(xì)菌生物被膜的致病特性及耐藥問題[15]，生物膜才引起了人們的廣泛重視，得到了深入的研究。

細(xì)菌生物膜中含水量高達(dá)97%左右，它是由蘑菇狀或類似堆狀的微菌落構(gòu)成，這些微菌落中間圍繞著“輸水通道”，能夠運送酶、養(yǎng)料、代謝產(chǎn)物等。實際上，生物膜是有著復(fù)雜結(jié)構(gòu)的“建筑物”，而并非是一層薄膜，成熟的生物膜模型從外到內(nèi)包括主體生物膜層、連接層、條件層、基質(zhì)層，其結(jié)構(gòu)具有不均質(zhì)性[16]。

隨著技術(shù)研究的推進(jìn)，研究者發(fā)現(xiàn)生物膜不僅僅是由細(xì)菌和其包被著的外殼組成，也可是單一或多種微生物形成。生物膜中除了水和細(xì)菌外，還含有其分泌的大分子多聚物（如蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等）、吸附的營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物和細(xì)菌裂解產(chǎn)物等[17]。

2 生物膜的形成

生物膜的形成過程是一種動態(tài)的過程，其發(fā)展過程可以分為菌落的粘附、發(fā)展、成熟和老化4個階段[17-18]。

2.1 菌體的粘附

細(xì)菌在介質(zhì)表面的粘附是生物膜形成的首要條件，這種粘附力是由粘附因子或細(xì)菌表面的一些附屬結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的，具有特異性和選擇性。在此階段，沒有成熟的生物膜結(jié)構(gòu)保護(hù)，處于不穩(wěn)定狀態(tài)，抵抗性弱，一般通過沖洗加熱等方法就能被除掉。

2.2 生物膜的發(fā)展

細(xì)菌粘附到介質(zhì)表面之后，菌體中控制胞外基質(zhì)分泌的基因便隨之激活，在生長、繁殖的同時分泌大量的胞外多糖和胞外蛋白。胞外多糖能夠粘附單個細(xì)胞而形成微菌落，隨著胞外多糖的分泌增加，越來越多的微菌落形成從而致使生物膜逐漸加厚。此階段生物膜中細(xì)菌對抗生素等抗性顯著增加。

2.3 生物膜的成熟

細(xì)菌大量分泌胞外基質(zhì)，使得固生細(xì)菌被包裹在其中，形成結(jié)構(gòu)高度有組織的成熟的生物膜。由于菌種、營養(yǎng)、粘附介質(zhì)表面、環(huán)境條件的不同，細(xì)菌在增殖時，會形成疏松或者緊密或厚薄不等的生物膜結(jié)構(gòu)。在此階段，生物膜達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，對環(huán)境有著最強(qiáng)的抗性。

2.4 生物膜的老化

生物膜經(jīng)歷成熟期后，由于其內(nèi)在機(jī)制或者來自外方的沖刷，部分粘附或包裹在生物膜上的細(xì)菌脫落成浮游態(tài)，其可重新粘附到合適的介質(zhì)表面形成新的生物膜，而原有的生物膜厚度開始逐漸降低。

3 生物膜的耐藥機(jī)制

在正常情況下溶藻弧菌本身就具備一定的耐藥性，而抗生素的濫用更會造成耐藥性的大大增加，胡瓏玉等對海水中分離的33株溶藻弧菌進(jìn)行了20種常見抗生素的耐藥性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有分離菌均對3種及3種以上抗生素多重耐藥，同時對6種及6種以上抗生素耐藥的有15株（45.5%），同時對8種及8種以上抗生素耐藥的有6株（18.2%）[19]。然而，與浮游菌相比，當(dāng)細(xì)菌以生物膜形式存在時耐藥性明顯增強(qiáng)（10～100倍）。陳鐵柱等根據(jù)文獻(xiàn)報道，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制是以其多細(xì)胞結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，多種機(jī)制參與并介導(dǎo)的，并且在這些不同的機(jī)制之間還存在一定的協(xié)同作用[20]。目前針對生物膜耐藥機(jī)制的解釋，主要推測為以下3種：

3.1 黏質(zhì)物質(zhì)屏障假說

細(xì)菌分泌的胞外基質(zhì)是生物膜重要的組成部分，許多研究發(fā)現(xiàn)，胞外基質(zhì)是對生物膜耐藥性的一個重要影響因素。Thurnheer等采用熒光探針檢測發(fā)現(xiàn)，生物膜的通道是迂回的，這可能正是抗生素滲入生物膜受阻的原因所在[21]。有研究表明，胞外基質(zhì)帶負(fù)電荷，能夠吸收帶有正電荷的氨基糖苷類抗生素的氨基側(cè)鏈，阻礙抗生素對菌體的作用，從而導(dǎo)致抗生素殺菌的能力明顯下降[22]。

3.2 微環(huán)境假說

生物膜內(nèi)的細(xì)菌由于生長所需的營養(yǎng)不足、代謝物堆積、氧濃度降低等原因，導(dǎo)致其代謝活性緩慢，生長速度降低，甚至處于休眠期，對抗生素均不敏感。在對游離菌和生物膜菌株在對數(shù)期到靜止期耐藥性差別研究時，發(fā)現(xiàn)二者耐藥性均隨生長速度的減慢而加強(qiáng)，并都在靜止期表現(xiàn)出最高的耐藥性[23]。

3.3 基因表型改變假說

細(xì)菌在形成生物膜之后，為了適應(yīng)新的生長環(huán)境，某些在游離條件下不表達(dá)的基因被激活或者原本正常表達(dá)的基因在生物膜狀態(tài)下失去表達(dá)活性，從而使得生物膜菌株的生物學(xué)行為發(fā)生改變，導(dǎo)致耐藥機(jī)制的產(chǎn)生或加強(qiáng)。如銅綠假單胞菌在生物膜狀態(tài)下時約有 1%的基因不同于浮游菌，然而處于生物膜狀態(tài)下的大腸埃希菌約有 10% 的基因表達(dá)明顯不同于浮游菌[24]。

4 生物膜的鑒定方法

根據(jù)胡錦松等的文獻(xiàn)報道[25]，總結(jié)常見的生物膜鑒定方法主要有以下幾種：

4.1 微量板定量檢測法

微量板定量檢測法（polystyrene microtiter plate assay）是目前實驗室廣泛應(yīng)用的定量檢測細(xì)菌生物膜的方法[26]。2012年，姚剛等采用微孔板法研究靜置培養(yǎng)條件下致病性溶藻弧菌ND-01在酶標(biāo)板上成膜情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病性溶藻弧菌能夠在聚苯乙烯材料的96孔酶標(biāo)板表面形成穩(wěn)定而明顯的生物膜，且其生物膜的形成與多種環(huán)境因素有著密切關(guān)系[27]。

相對于平板計數(shù)鑒定法來說，微量板定量檢測法能夠大幅度縮小研究者的工作量，能較準(zhǔn)確地反映生物膜含量，這對實驗室生物膜研究工作是非常有利的。

4.2 銀染法

銀染法（silver staining method）是指經(jīng)銀染著色后的生物膜在普通顯微鏡下進(jìn)行觀察的一種鑒定方法。相比于掃描電鏡法，銀染法觀察BF簡單易行，價格低廉，并且敏感性好，特異性強(qiáng)，可用于普通實驗室生物膜的常規(guī)鑒定。

姚慧琳等用銀染法及掃描電鏡法對銅綠假單胞菌生物膜效果進(jìn)行觀察鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀染后普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對生物膜觀察結(jié)果相符[28]。但是，生物膜在銀染過程中會受到試劑不同程度的影響，其結(jié)構(gòu)形態(tài)會發(fā)生不同程度的改變;并且，其也只能用于觀察生物膜的外層結(jié)構(gòu)[25]。

4.3 掃描電鏡和透射電鏡法（SEM，TEM）

掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）的使用讓人類對生物膜的觀察進(jìn)入了亞顯微水平，其能觀察到生物膜不同生長時期的結(jié)構(gòu)形態(tài)。SEM能觀察生物膜的表層結(jié)構(gòu)，而TEM和特殊多糖染色（如剛果紅染色）能夠更好地觀察生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。然而電鏡技術(shù)費用昂貴且標(biāo)本制備復(fù)雜，不太適用于細(xì)菌生物膜的常規(guī)實驗室檢測。

4.4 激光共聚焦掃描顯微鏡法（CLSM）

CLSM法常用于細(xì)菌生物被膜立體結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)研究。1982年，Marrie等利用CSLM法觀察到生物膜結(jié)構(gòu)中的水道以及其中流動的液體，這在生物膜結(jié)構(gòu)上的認(rèn)識是一個重大的突破[29]。Naves等在2007年采用CLSM法研究大腸桿菌生物膜的形成能力與毒力關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)有5個毒力相關(guān)基因普遍存在于生物膜菌株中[30]。然而，使用CLSM方法價格昂貴，很難普及，目前在國內(nèi)，CLSM法在生物膜方面的應(yīng)用研究還比較緩慢。

5 生物膜抑制

5.1 抗生素的使用

體外試驗證明，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有抗細(xì)菌生物膜的作用，但并不是所有的大環(huán)內(nèi)酯類藥物都具有抑制細(xì)菌生物膜的作用。有很多研究顯示，14-環(huán)的紅霉素[31]、克拉霉素、羅紅霉素，15-環(huán)的阿齊霉素[32]均在低于MIC的濃度下有抑制細(xì)菌生物膜的作用，而16-環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類如麥迪霉素[33]，交沙霉素[34]等無論劑量多大均無此效果。

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