馬保亮 魏良淑 劉桂玲 盧禮萍

摘要：在pH=7.0，t=37℃條件下，采用熒光光譜和紫外可見(jiàn)-吸收光譜研究了β-紫羅蘭酮與β-乳球蛋白的相互作用。研究的結(jié)果表明：這種相互作用使β-乳球蛋白發(fā)生內(nèi)源熒光猝滅，其機(jī)制為靜態(tài)猝滅。通過(guò)計(jì)算得到了兩者的結(jié)合常數(shù)（k=0.605×103L/mol）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n=1）。

關(guān)鍵詞： β-紫羅蘭酮;β-乳球蛋白;熒光猝滅; 同步熒光譜; 紫外可見(jiàn)-吸收光譜;

引言

β-紫羅蘭酮（β-ionone） 是一種芳香族化合物，結(jié)構(gòu)（如圖2）中含有一個(gè)芳香苯環(huán)，具有疏水性。它廣泛存在于天然食物中，比如水果、蔬菜、谷物及牛奶中，在醫(yī)藥工業(yè)中還可以用于合成維生素A和β-胡蘿卜素[4，5]，這與人們的生活息息相關(guān)。β-紫羅蘭酮是一個(gè)單體，卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗癌作用[6，7]。研究蛋白質(zhì)與β-紫羅蘭酮的相互作用，可以為了解β-紫羅蘭酮的生物活性機(jī)制提供重要線索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

F-4600型熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）;UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海Shimadzu公司）;UB-10標(biāo)準(zhǔn)型PH計(jì)（上海華耀貿(mào)易公司 ）;FA1604B型電子分析天平（北京賽多利斯有限公司）;

β-乳球蛋白和β-紫羅蘭酮購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司;磷酸鈉緩沖液所用試劑為國(guó)內(nèi)生化公司購(gòu)置的分析純;所用水為超純?nèi)ルx子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱量β-紫羅蘭酮并配置成濃度為1mmol/L的溶液，準(zhǔn)確稱量β-乳球蛋白并配置成5 mg/ml的溶液，其中使用的緩沖液均為磷酸鈉緩沖液（pH=7.0），置于4 的冰箱中保存。

在10 ml比色管中依次加入pH=7.0的緩沖溶液、1.0mlβ-乳球蛋白溶液和一定量的β-紫羅蘭酮溶液，然后在27 和37 水浴鍋中充分培養(yǎng)30分鐘后開始測(cè)試熒光光譜。

熒光光譜測(cè)量，激發(fā)光狹縫和發(fā)射光狹縫均為2.5nm。內(nèi)源發(fā)射熒光是以280nm作為激發(fā)光波長(zhǎng)，記錄300nm-400nm范圍的發(fā)射光譜;同步熒光是固定激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的間距 分別為15nm和60nm， 記錄240-320nmm范圍的熒光光譜。紫外可見(jiàn)-吸收光譜測(cè)量范圍為200nm到340nm 。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 β-紫羅蘭酮對(duì)β-乳球蛋白的猝滅反應(yīng)

β-LG蛋白分子中含有色氨酸和酪氨酸等氨基酸，具有較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。固定β-LG溶液濃度為0.05mg/ml，在其中加入不同濃度的β-紫羅蘭酮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-LG的熒光峰隨著β-紫羅蘭酮濃度的增加而規(guī)律性降低，同時(shí)β-乳球蛋白的最大發(fā)射峰位發(fā)生5nm左右的紅移，如圖3所示，表明β-LG蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生了一定的改變。

對(duì)于靜態(tài)猝滅，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可由結(jié)合常數(shù)表達(dá)式（2）推導(dǎo)求出[10 ]：

（2）

2.4β-乳球蛋白與β-紫羅蘭酮之間的能量轉(zhuǎn)移效率和結(jié)合距離

根據(jù)F?rster 非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[11]，可以求出小分子與蛋白質(zhì)發(fā)光基團(tuán)之間的距離。

能量轉(zhuǎn)移效率E與供體-受體之間距離r及能量轉(zhuǎn)移距離臨界R0的關(guān)系為：

（6）

R0為能量轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的距離。

（7）

其中 為取向因子，可取受能體與供能體各向隨機(jī)分布的平均值 ; 為介質(zhì)的折射指數(shù)，一般取水和有機(jī)物折射指數(shù)的平均值1.336， 為供能體的光量子產(chǎn)率，通常取蛋白質(zhì)色氨酸量子產(chǎn)率為0.118，J為供能體的熒光發(fā)射譜與受能體的吸收光譜的重疊積分，可表示為：

（8）

其中 為供能體在波長(zhǎng) 處的熒光強(qiáng)度， 為受能體在波長(zhǎng) 處的摩爾吸光系數(shù)。摩爾能量轉(zhuǎn)移效率可以由下式?jīng)Q定：

（9）

式中F0為能量受體不存在時(shí)能量供體的熒光發(fā)射強(qiáng)度， F為能量供體和受體濃度為1：1時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度 。

圖5為供能體與受能體濃度為1：1時(shí)，供能體β-乳球蛋白的熒光發(fā)射光譜（a）與受能體β-紫羅蘭酮的吸收光譜（b）的光譜重疊。將圖中光譜重疊部分分割成極小的矩形面積求和，應(yīng)用公式（8）算得重疊積分為

代入方程（7）得到臨界距離為 。由式（9）計(jì)算得到能量轉(zhuǎn)移效率為 。根據(jù)公式（6）可以算出β-紫羅蘭酮與β-乳球蛋白熒光殘基間的距離為 。該距離小于7nm，符合能量轉(zhuǎn)移理論。

2.6 β-紫羅蘭酮對(duì)β-乳球蛋白構(gòu)象的影響

β-紫羅蘭酮加入β-乳球蛋白溶液中，兩者發(fā)生了結(jié)合猝滅反應(yīng)的同時(shí)發(fā)射峰位紅移，我們可將通過(guò)同步熒光和紫外可見(jiàn)-吸收光譜進(jìn)一步研究β-紫羅蘭酮對(duì)β-乳球蛋白構(gòu)象的影響。

3 結(jié)論

以β-乳球蛋白為基體，通過(guò)熒光光譜和紫外可見(jiàn)-吸收光譜研究了β-紫羅蘭酮與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)。β-紫羅蘭酮進(jìn)入蛋白質(zhì)分子的疏水腔與疏水氨基酸通過(guò)氫鍵和范德華力發(fā)生作用，這與β-紫羅蘭酮分子的疏水性有關(guān)。因?yàn)閮烧叩慕Y(jié)合作用，一方面，蛋白質(zhì)發(fā)射熒光強(qiáng)度被猝滅，測(cè)算結(jié)果表明藥物和發(fā)生作用的氨基酸之間作用距離較大，但仍滿足非輻射能量轉(zhuǎn)移的條件，這也導(dǎo)致了明顯的熒光猝滅;另外，同步熒光光譜中色氨酸熒光發(fā)射峰位紅移，體現(xiàn)了藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)靠近處于疏水區(qū)的色氨酸殘基，并引起了色氨酸所在環(huán)境疏水性的變化。紫外可見(jiàn)-吸收光譜中190nm附近較強(qiáng)的吸收峰也發(fā)生了顯著紅移，這也進(jìn)一步證明了β-紫羅蘭酮的加入影響了生色團(tuán)的疏水環(huán)境。

參考文獻(xiàn)

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