徐倩　馮青　歐俊　等

[摘要] 目的 構(gòu)建一種長效、靶向的攜帶促骨形成藥物HU-308的藥物緩釋種植體，觀察其體外緩釋特性。方法 采用層層靜電自組裝技術(shù)制備不同層數(shù)的肝素/殼聚糖涂層，以物理吸附的方式裝載促骨形成藥物HU-308，構(gòu)建載藥種植并進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。通過紫外可見光分光光度計(jì)測定藥物濃度，分析不同涂層數(shù)載藥種植體的加載效率及釋放規(guī)律。用掃描電鏡、原子力顯微鏡觀察涂層表面形貌和結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 成功地制備了載HU-308涂層種植體。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，隨著涂層層數(shù)的增加，載藥量逐漸增加，但T20組略有下降。隨著層數(shù)的增加，HU-308的釋放速度隨之減緩，緩釋能力增強(qiáng)。掃描電鏡、原子力顯微鏡結(jié)果表明種植體表面肝素/殼聚糖涂層逐漸形成。結(jié)論 層層靜電自組裝技術(shù)成功構(gòu)建載有HU-308的涂層種植體，可長期有效釋放達(dá)30 d以上，這有望為臨床上提高骨質(zhì)疏松癥患者種植體骨整合率提供一種新的可能。

[關(guān)鍵詞] 鈦種植體； 藥物緩釋； HU-308； 層層靜電自組裝； 肝素； 殼聚糖

[中圖分類號] R 783.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.002

骨質(zhì)疏松癥作為一種全身系統(tǒng)性疾病，影響了頜骨的骨質(zhì)量和骨密度[1]，進(jìn)而影響了頜骨種植體的成功率，如何提高骨質(zhì)疏松癥患者的種植成功率一直以來都是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)的全身給藥不僅用藥量大、有不良反應(yīng)且作用于種植體局部的效果不佳。純鈦?zhàn)鳛檠婪N植材料，有著良好的機(jī)械性能和生物相容性，但其屬于惰性材料，缺乏生物活性，無骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)能力且植入后愈合周期長[2]；因此，很多學(xué)者開始研究對種植體表面進(jìn)行處理，嘗試在種植體局部載藥來解決這些問題。層層靜電自組裝技術(shù)（layer-by-layer electrostatic self-assembly，LBL）[3]是基于聚電解質(zhì)陰陽離子所帶正負(fù)電荷間相互作用的一種自組裝超分子技術(shù)。其原理[4]是分子靜電自組裝，通過靜電力的作用依次吸附上帶異種電荷的聚電解質(zhì)，交替沉積形成自組裝多層涂層，而同時(shí)電荷間的排斥力又使每一層的吸附量不會無限增加，而是在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到飽和。本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于構(gòu)建一種肝素（heparin，Hep）/殼聚糖（chitosan，Chi）涂層種植體，并裝載促骨形成藥物HU-308，使其在種植體周圍形成較高藥物濃度的同時(shí)亦可進(jìn)行緩慢持久的釋放，以誘導(dǎo)種植體周圍成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)新骨的形成，以期為今后提高骨質(zhì)疏松患者的種植骨整合率提供一種新的可能。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

商業(yè)純鈦微種植體，直徑2 mm，長4 mm（TA2，純度99.9%，陜西寶雞力華公司）。多聚左旋賴氨酸（Sigma公司，美國），肝素鈉（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），殼聚糖（浙江澳興生物科技有限公司），HU-308（Cayman公司，美國）。

雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）（VEGA3，TESCAN公司，捷克），原子力顯微鏡（atomic force micros-cope，AFM）（Ntmdt公司，俄羅斯）。

1.2 鈦種植體的堿熱水處理

取50顆鈦種植體依次置于丙酮-無水乙醇-去離子水中超聲清洗，40 ℃干燥。再浸入5 mol·L-1的NaOH溶液中80 ℃活化24 h，然后使用去離子水超聲清洗

3次，每次10 min。接著將堿處理后的鈦種植體浸入60 ℃去離子水中陳化24 h，用去離子水超聲清洗，40 ℃干燥備用。

1.3 肝素/殼聚糖涂層的制備及分組

將殼聚糖在1%乙酸中溶解，制成pH=4、質(zhì)量濃度為5 g·L-1的聚陽離子溶液；肝素溶解在去離子水中，制成pH=4、質(zhì)量濃度為5 g·L-1的聚陰離子溶液；多聚左旋賴氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制成pH=7.2、質(zhì)量濃度為2.5 g·L-1的聚陽離子溶液。將堿熱水處理過后的樣品浸入PLL溶液中30 min，獲得一個(gè)穩(wěn)定的帶正電的前驅(qū)體層，為LBL[3]自組裝程序的初始層，去離子水漂洗5 min，氮?dú)獯蹈?；再將樣品依次浸入肝素、殼聚糖溶液中，每次浸?0 min，去離子水漂洗1 min，氮?dú)獯蹈?。重?fù)上述循環(huán)n次即可得到最終所要求的自組裝涂層Ti/PLL/（Hep/Chi）n，每次循環(huán)最后一層以殼聚糖層終止。

本實(shí)驗(yàn)中50顆鈦種植體平均分為5組： T0組（對照組、無涂層）、T5組（5層涂層）、T10組（10層涂層）、T15組（15層涂層）、T20組（20層涂層），每組10顆。按照上述方法制備所需涂層種植體，室溫干燥后待用。

1.4 HU-308標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.4.1 HU-308吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線 將乙醇和PBS按1︰2的比例混合配制成標(biāo)準(zhǔn)的稀釋溶劑。然后取一定量的HU-308溶于標(biāo)準(zhǔn)的稀釋溶劑中，分別配制成0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 g·L-1的一系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，不含藥物的溶液作為空白對照，采用紫外分光光度計(jì)測定所配標(biāo)準(zhǔn)溶液在233 nm波長處的光密度值（A值），以A值對濃度C進(jìn)行回歸，獲得回歸方程A=8.914 3C+0.031 4，R?=

0.999 2。

1.4.2 HU-308釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線 釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法同吸收曲線，釋放溶劑為pH=7.2的PBS緩沖溶液。用同樣的方式配制一系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，紫外分光光度計(jì)在233 nm波長處測定A值，以A值對濃度C進(jìn)行回歸，獲得回歸方程A=4.138 8C-0.027 9，R?=

0.999 1。

1.5 HU-308的裝載

將各組鈦種植體浸沒于促骨形成藥物HU-308溶液中，常溫下靜置，利用物理吸附法負(fù)載藥物，間隔一定時(shí)間取出部分溶液用紫外分光光度計(jì)于選定波長處測定其光密度值，直至光密度值無明顯變化時(shí)停止測量。對照HU-308吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出HU-

308的濃度。

1.6 HU-308體外釋放實(shí)驗(yàn)

常溫下配制釋放介質(zhì)PBS緩沖溶液，pH值為7.2。將裝載有HU-308的鈦種植體浸沒到1 mL的PBS緩沖溶液中進(jìn)行藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)，36.5 ℃±0.5 ℃、50 r·min-1 轉(zhuǎn)速的水浴環(huán)境下，分別于1～30 d中每隔2 d定時(shí)取樣，并更換等量PBS溶液1 mL，用紫外分光光度計(jì)測量每個(gè)時(shí)段樣品溶液在233 nm處的紫外光密度值，直到無藥物釋放為止。對照藥物釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線得出每個(gè)時(shí)點(diǎn)樣品濃度C，可以計(jì)算出每個(gè)時(shí)段下的累積釋放百分率，繪制累積釋放藥物質(zhì)量百分率-時(shí)間的藥物體外釋放曲線，從而分析自組裝層數(shù)對釋藥行為的影響。

1.7 表面形貌觀察

從每組鈦種植體中隨機(jī)抽取2顆，分別用作SEM和AFM觀察。對堿處理以及涂層改性后純鈦種植體表面進(jìn)行表征，觀察鈦種植體表面微觀形貌結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果

2.1 各組鈦種植體HU-308裝載量

T0、T5、T10、T15、T20組鈦種植體的平均載藥量分別為0.140 2、0.163 8、0.164 6、0.167 2、0.164 1 mg；載藥百分比分別為61.40%、71.72%、72.09%、73.22%、71.87%。隨著涂層層數(shù)的不斷增加，T0至T15組載藥量逐漸增加，但T20組有輕微下降。T0組與實(shí)驗(yàn)各組之間載藥量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），T5、T10、T20組間載藥量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），T15組與其他組載藥量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 HU-308的體外釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HU-308的釋放曲線見圖1。由圖1可見，各組均為逐漸上升的曲線。當(dāng)釋放第1天時(shí)，對照組T0組即表現(xiàn)出明顯的藥物突釋現(xiàn)象，釋放出藥物總量的28.22%；T5、T10、T15、T20組分別釋放出藥物總量的19.24%、17.29%、15.46%、11.36%。當(dāng)釋放第2天時(shí)，T0組已累積釋放超過50%的藥量，而T5、T10、T15、T20組釋放出50%藥物的時(shí)間分別是4、8、12、14 d。隨著鈦種植體涂層層數(shù)的增加，早期突釋現(xiàn)象逐漸減弱。T0組在第10天時(shí)已經(jīng)釋放出載藥總量的95.93%，然而T20組30 d的累積釋放量僅是總量的64.93%，且仍有藥物釋出的跡象。由此可見，隨著涂層數(shù)的不斷增加，HU-308的釋放速度隨之減緩，緩釋能力不斷增強(qiáng)。

圖 1 HU-308累計(jì)釋放曲線

Fig 1 Cumulative percentage release profile of HU-308

2.3 鈦種植體表面形貌和顯微結(jié)構(gòu)

2.3.1 SEM下觀察 3組不同層數(shù)涂層種植體的表面形貌見圖2。SEM（10 000倍）下可見：堿處理后的T0組種植體表面形成多孔，孔隙大小約為微米到亞微米級（圖2左）；隨著涂層層數(shù)的增加，表面多孔結(jié)構(gòu)逐漸消失，鈦種植體表面逐漸被層層覆蓋（圖2中），當(dāng)組裝到20個(gè)循環(huán)時(shí)種植體表面已被完全覆蓋，原凹凸不平的表面已逐漸均勻、平整（圖2右）。

2.3.2 AFM下觀察 用AFM觀察涂層種植體表面微觀形貌，輕敲模式下隨機(jī)選擇10 μm×10 μm的微范圍進(jìn)行圖像采集。AFM二維圖片顯示：NaOH處理后鈦種植體表面是由卵圓形和圓形顆粒組成；隨著涂層層數(shù)的增加，卵圓形顆粒集聚重疊，種植體表面越來越平滑（圖3）。從AFM三維立體圖可見，隨著層數(shù)的增加，堿處理后所形成的島狀/球形排列的粗糙突起逐漸平滑、均勻（圖4）。AFM測得T0、T10、T20的鈦種植體表面微觀粗糙度分別為（102.72±1.3）、（71.87±1.7）、（45.20±0.9） nm，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用靜電的相互作用，在鈦種植體表面交替吸附聚陰離子肝素與聚陽離子殼聚糖，所形成的涂層比普通的物理吸附更加穩(wěn)定[5]；而實(shí)驗(yàn)前期對鈦種植體的堿熱水陳化處理可以使種植體表面形成均勻、多孔的結(jié)構(gòu)，從而增加了表面親水性和電荷密度，形成富含羥基的活性表面[6-8]，可以組裝更多的聚電解質(zhì)，有利于涂層與種植體的結(jié)合，使肝素/殼聚糖涂層能夠良好的吸附于鈦種植體表面。

涂層的層數(shù)與藥物的裝載量及釋放能力有關(guān)。Haidar等[9]利用層層靜電自主裝技術(shù)包覆生物大分子藥物，交替沉積的藻酸鹽/殼聚糖多層膜提高了聚電解質(zhì)穩(wěn)定性從而增強(qiáng)了藥物裝載率。Ye等[10]將殼聚糖和海藻酸鈉層包覆吲哚美辛緩釋藥物，結(jié)果表明聚電解質(zhì)層數(shù)和微膠囊緩釋性能有關(guān)。有學(xué)者制備了不同涂層的殼聚糖乙酸鹽/葡聚糖硫酸鈉涂層來裝載布洛芬，并在PBS溶液和HCl溶液中進(jìn)行釋放，研究得出涂層厚度與組裝量成正比，當(dāng)層數(shù)增加時(shí)，涂層厚度增加，布洛芬釋放速率減慢。為了研究二者之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過改變肝素/殼聚糖涂層的層數(shù)來觀察其對藥物裝載和釋放的能力。選擇HU-

308作為本研究的加載藥物，HU-308是一種特殊的CB2大麻素受體激動劑，它通過激活不同分化能力的成骨細(xì)胞和抑制破骨細(xì)胞的形成來維持正常的骨量和骨密度[11-13]。本實(shí)驗(yàn)通過LBL技術(shù)構(gòu)建肝素/殼聚糖生物活性涂層，并用物理吸附的方式將HU-308負(fù)載至種植體表面，涂層表面的層狀水凝膠結(jié)構(gòu)可使藥物富集形成局部高濃度，從而靶向的將藥物向周圍傳遞，局部的高濃度藥物可以提高治療的有效性，降低系統(tǒng)毒性。從本研究結(jié)果可見，T0與實(shí)驗(yàn)各組HU-308裝載量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這說明肝素/殼聚糖自組裝涂層有利于促骨形成藥物HU-308的吸附和裝載。隨著涂層層數(shù)的不斷增加，T0到T15組載藥量逐漸增加，這與Ye等[10]的研究結(jié)果類似；然而當(dāng)組裝層數(shù)達(dá)到20層時(shí)，種植體的載藥量卻輕微下降，當(dāng)自組裝層數(shù)到20層時(shí)，過大的分子鏈密度影響了涂層的透過性，部分HU-308分子無法進(jìn)入，因而T20組HU-308裝載量有所下降。李小燕等[14]亦報(bào)道隨著自組裝層數(shù)的增加，增大了分子鏈堆積密度，藥物較難透過緩釋體系膜。

體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示T0組在釋放初期突釋現(xiàn)象明顯，當(dāng)釋放第2天時(shí)，T0組已累積釋放超過50%的藥量，在第10天時(shí)幾乎已無藥物釋出，釋放量為95.93%。而實(shí)驗(yàn)組則表現(xiàn)出不同程度的緩釋能力，隨著肝素/殼聚糖涂層數(shù)的增加，初期突釋的現(xiàn)象得到緩解，緩釋能力不斷增強(qiáng)，T5、T10、T15、T20組釋放出50%藥物的時(shí)間分別是4、8、12、14 d。本研究只測試了藥物釋放30 d的曲線，從釋放曲線可見，T10、T15、T20組均可持續(xù)釋放達(dá)30 d之久。破骨細(xì)胞吸收期約在骨重建開始后維持1個(gè)月的時(shí)間，因此若在此階段進(jìn)行干預(yù)，載藥種植體的藥物釋放時(shí)間可以滿足需要；然而何種濃度是抑制破骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的最佳濃度，從而最終達(dá)到有效提高骨質(zhì)疏松癥患者種植體骨整合的目的，本課題組將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探索。

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（本文編輯 杜冰）