雷晗梟 陳國偉 李曉輝 夏珊珊 吳美仙

摘要 [目的]為高職學(xué)生實(shí)驗(yàn)《多酚氧化酶的制備和性質(zhì)研究》篩選合適的實(shí)驗(yàn)材料。[方法]選取馬鈴薯和紫薯比較研究塊莖與塊根中多酚氧化酶（PPO）的活性、最適底物、最適溫度等特性。[結(jié)果]兩者PPO最適底物均為鄰苯二酚;馬鈴薯PPO的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，紫薯PPO的最適反應(yīng)溫度為10 ℃。[結(jié)論]經(jīng)綜合比較，該實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯作為實(shí)驗(yàn)材料更為合適。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯;紫薯;多酚氧化酶;活性

中圖分類號(hào) S532 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11617-02

Comparision of Some Natures of Polyphenol Oxidase in Stem Tuber and Root Tuber

LEI Han-xiao， CHEN Guo-wei， LI Xiao-hui， WU Mei-Xian* et al

（Xiaoshan College of Science and Technology， Zhejiang Ocean University， Hangzhou， Zhejiang 311215）

Abstract [Objective]The objective of this study was to choose ideal experiment material for the students experiments-The Making and Natures Study of Polyphenol Oxidase（PPO） in higher vocational education. [Method]The potato and purple potato were selected to study some natures of PPO， including its activity， optimum substrate and optimum reaction temperature. [Result] Both of their optimum substrates were Catechol. The optimum reaction temperature of potato was 35 ℃，while that of purple potato was 10 ℃. [Conclusion]After comprehensive comparison， potato was more ideal as experiment material than purple potato in this experiment.

Key words Potato; Purple potato; Polyphenol oxidase （PPO）; Activity

基金項(xiàng)目 2013年度浙江海洋學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（自然科學(xué)類）（浙海院團(tuán)〔2013〕38號(hào)）; 浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201225035）。

作者簡介 雷晗梟（1992- ），女，浙江臨安人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)及應(yīng)用。*通訊作者，高級講師，碩士，從事生物化學(xué)的教學(xué)和研究工作。

收稿日期 2014-10-16

在高職生物化學(xué)《多酚氧化酶的制備和性質(zhì)研究》實(shí)驗(yàn)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與教材中的理論結(jié)果不一致。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可能有所欠缺。馬鈴薯的最適溫度為5 ℃[1] 。在底物專一性這一實(shí)驗(yàn)過程中，并沒有控制在最適pH和溫度下完成。所以，可能正是這一原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)結(jié)果與理論結(jié)果出現(xiàn)差異。此外，還發(fā)現(xiàn)不同蔬菜、水果的多酚氧化酶最適pH和溫度不同，最適底物也有所差異[2-8]。為此，筆者將溫度和pH調(diào)至最適后，選用價(jià)廉易得的馬鈴薯、紫薯作為試驗(yàn)品來驗(yàn)證、完善該實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為學(xué)生實(shí)驗(yàn)材料的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為馬鈴薯、紫薯。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯和紫薯PPO反應(yīng)特性研究。

1.2.1.1 馬鈴薯和紫薯PPO粗酶液的提取。

參考李敏等[1]方法，并且改進(jìn)。取一馬鈴薯，洗去上面的泥土，削皮后切成小塊。稱200 g小塊馬鈴薯，立即加入磷酸鹽緩沖液（pH 5.5），放入組織搗碎機(jī)中研磨2 min。把勻漿物料通過幾層紗布過濾。將濾液于4 ℃、4 000 r/min下離心25 min，上清液即為酶提取液。將酶提取液置于4 ℃冰箱冷藏，待用時(shí)取出。

參考李新華等[9]方法，并且改進(jìn)。隨機(jī)稱取50.0 g紫薯樣品，迅速切成小塊于組織搗碎勻漿機(jī)中，加入200 ml預(yù)冷的4 ℃磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），勻漿40 s后過濾，將濾液在4 ℃、8 000 r/min冷凍離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.2.1.2 馬鈴薯和紫薯PPO最大吸收波長的確定。

分別取2 ml馬鈴薯和紫薯PPO粗酶液于試管中，置沸水?。?0 ℃以上）加熱1 min，使酶失活，反應(yīng)產(chǎn)物在波長240～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.1.3 馬鈴薯和紫薯PPO酶促反應(yīng)最佳反應(yīng)時(shí)間的確定。

分別取2 ml馬鈴薯和紫薯PPO粗酶液于一試管中，置沸水浴（80 ℃以上）加熱1 min使酶失活。取出，待試管冷卻后，在各試管中加4 ml蒸餾水。每隔5 min，檢測馬鈴薯PPO在波長350 nm處、紫薯PPO在波長330 nm處的吸光度變化，確定其酶促反應(yīng)的最適反應(yīng)時(shí)間。

1.2.1.4 馬鈴薯和紫薯PPO最適底物的確定。

取馬鈴薯PPO粗酶液各2.0 ml于3支試管中，分別加入4.0 ml 0.2 mol/L的鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚，于10 ℃溫度條件下保溫反應(yīng)10 min，測定其酶活力，吸光度最高的即為其最適底物。

取紫薯PPO粗酶液各2.0 ml于3支試管中，分別加入4.0 ml 0.2 mol/L的鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚，于35 ℃溫度條件下保溫反應(yīng)10 min，測定其酶活力，吸光度最高的即為其最適底物。

1.2.1.5 馬鈴薯和紫薯PPO最適溫度的確定。

分別取馬鈴薯和紫薯粗酶液各2.0 ml于4支試管中，再加入4.0 ml 0.2 mol/L的鄰苯二酚底物，分別于10、20、30、40 ℃溫度條件下保溫反應(yīng)10 min，測定其酶活力，吸光度最高時(shí)的溫度即為其最適反應(yīng)溫度。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)分析。

每次測定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯和紫薯PPO最大吸收波長的確定

由圖1可知，在320～350 nm范圍內(nèi)，隨著波長的增加，馬鈴薯吸光度逐漸增大;在350～400 nm范圍內(nèi)，隨著波長的增加，吸光度逐漸減小，馬鈴薯的最大吸收波長為350 nm。在240～330 nm范圍內(nèi)，隨著波長的增加，紫薯吸光度略為增大;在330～400 nm范圍內(nèi)，隨著波長的增加，吸光度逐漸減小，紫薯的最大吸收波長為330 nm。

圖1 馬鈴薯和紫薯PPO最大吸收波長的比較

2.2 馬鈴薯和紫薯中PPO酶促反應(yīng)進(jìn)程及最佳反應(yīng)時(shí)間的比較

由圖2可知，馬鈴薯PPO酶促反應(yīng)速率在10 min內(nèi)，隨著時(shí)間的推進(jìn)反應(yīng)加快，10 min時(shí)反應(yīng)趨于穩(wěn)定，之后反應(yīng)變慢;紫薯PPO酶促反應(yīng)速率的變化規(guī)律與馬鈴薯的一致。所以，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)中涉及的反應(yīng)時(shí)間均為10 min。

圖2 馬鈴薯和紫薯PPO酶促反應(yīng)進(jìn)程及最佳反應(yīng)時(shí)間的比較

2.3 馬鈴薯和紫薯PPO最適底物的確定

由圖3可知，馬鈴薯的最適底物為鄰苯二酚，其次是對苯二酚。由圖4可知，紫薯的最適底物為鄰苯二酚，其次是對苯二酚。

圖3 馬鈴薯PPO最適底物

圖4 紫薯PPO最適底物

2.4 馬鈴薯和紫薯PPO最適反應(yīng)溫度的比較 由圖5可知，隨著溫度的提高，馬鈴薯PPO活性增加，15 ℃時(shí)出現(xiàn)一小波峰;以后隨著溫度的升高，PPO活性迅速下降;當(dāng)溫度升至35 ℃時(shí)，出現(xiàn)最高波峰，此時(shí)的PPO活性最大。隨著溫度

的提高，紫薯PPO活性增加，10 ℃時(shí)出現(xiàn)波峰，此時(shí)的PPO活性最大;以后隨著溫度的升高，PPO活性迅速下降;當(dāng)溫度升至40 ℃時(shí)，又出現(xiàn)小波峰。小波峰的存在可能預(yù)示著存在同工酶[1]。因此，馬鈴薯、紫薯PPO的最適溫度分別是35、10 ℃。

圖5 馬鈴薯和紫薯PPO最適反應(yīng)溫度

3 結(jié)論

就粗酶液提取方法來說，紫薯PPO粗酶液提取方法更簡便，作為實(shí)驗(yàn)材料比較合適;但就PPO的最適溫度來看，馬鈴薯、紫薯PPO的最適溫度分別是35、10 ℃，就學(xué)生的群體實(shí)驗(yàn)來說，35 ℃比10 ℃更易控制。因此，《生物化學(xué)》學(xué)生實(shí)驗(yàn)課以馬鈴薯作為實(shí)驗(yàn)材料更為合適。

參考文獻(xiàn)

[1] 李敏，劉磊，郭玉蓉，等.馬鈴薯多酚氧化酶的特性研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（2）：189-192.

[2] 畢陽，歐陽春光.蘋果梨多酚氧化酶（PPO）的部分特性[J].食品科學(xué)，2001，22（12）：29-31.

[3] 楊明，汪志君.蓮藕中多酚氧化酶特性的研究[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，17（1）：47-51.

[4] 姜紹通，羅志剛，潘麗軍.甘薯中多酚氧化酶活性的測定及褐變控制[J].食品科學(xué)，2001，22（3）：19-22.

[5] 肖卓炳，陳上，麻明友，等.獼猴桃軟變及其多酚酶與動(dòng)力學(xué)研究[J].吉首大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，21（2）：6-8.

[6] 張福平，張喜春.佛手瓜多酚氧化酶酶學(xué)特性研究[J].食品科學(xué)，2010，31（1）：161.

[7] 譚興杰，李月標(biāo).荔枝（Litchi chinensis）果皮多酚氧化酶的部分純化及性質(zhì)[J].植物生理學(xué)報(bào)，1984，10（4）：339.

[8] 孔龍，霍瑞貞，裴茂清.蕉皮酚酶催化反應(yīng)的抑制動(dòng)力學(xué)及機(jī)理研究[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1994，22（2）：81-88.

[9] 李新華，高路.紫薯多酚氧化酶酶促反應(yīng)最適條件的研究[J].糧油食品科技，2008，16（3）：42-45.