陸勝利 祁超

摘要 [目的] 測定海洋放線菌S.areniocola CNS-205腺苷化結構域基因sare0357的酶活。[方法] 選取海洋放線菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS A domain基因sare0357，對其進行克隆表達和功能鑒定。[結果] 在以Trp為底物時測定Sare0357蛋白的酶動力學參數為：Km=（0.040 33±0.003 67）mmol/L，Vmax =（2.135 05±0.029 43）μmol/（min·L），kcat =（14.233 6±0.196 2）min;Phe為底物時：Km=（0.027 65±0.001 51）mmol/L，Vmax =（1.558 06±0.009 7）μmol/（min·L），kcat=（10.387 1 ±0.064 6）min。[結論]豐富洋放線菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS腺苷化結構域的底物特異性和密碼子領域的研究，為組合生物學和體外酶系合成NRPs提供依據。

關鍵詞 海洋放線菌;非核糖體多肽合成酶;腺苷化結構域;底物特異性;sare0357

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11632-04

Determination of Enzyme Activity of sare0357， a Gene of Adenylation Domain from Marine Actinomycete S.arenicola CNS-205

LU Sheng-li1， QI Chao2*

（1. Medical department， Anqing Medical College， Anqing， Anhui 246052;

2. Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology， College of Life Sciences，Huazhong Normal University， Wuhan，Hubei 430079）

Abstract [Objective] The aim was to determine enzyme activity of sare0357， a gene of adenylation domain from marine actinomycete S.arenicola CNS-205. [Method] Marine actinomycetes Salinispora arenicola CNS - 205 NRPS A domain gene sare0357 was selected， and the cloning expression and function identification were done. [Result] It was found that Sare0357 could recognize specifically and activate tryptophan （Try） and phenylalanine （Phe）. The basic kinetic parameters of it for these two substrates were detected as Km = （0.040 33±0.003 67） and （0.027 65 ±0.001 51）mmol/L， Vmax = （2.135 05±0.029 43） and （1.558 06 ±0.009 7）μmol/min and kcat =（14.233 6±0.196 2） and （10.387 1 ±0.064 6） min for Try and Phe respectively. [Conclusion] The aim riched ocean actinomycetes Salinispora arenicola CNS-205 NRPS of adenosine structure domain research in the field of the substrate specificity and codes， and provided the basis for combination of biology and enzyme system in vitro synthetic NRPS .

Key words Marine actinomycete; Nonribosomal peptide synthetases;Adenylation domain

基金項目 國家自然科學基金項目（20772040）;教育部中央高校自主項目（CCNU14F01006）。

作者簡介 陸勝利（1966-），男，安徽安慶人，講師，從事無機與分析化學研究。*通訊作者。

收稿日期 2014-10-15

海洋放線菌能通過非核糖體多肽合成酶（NRPSs）合成一系列的具有藥用價值的生物活性物質——非核糖體多肽（NRPs）。非核糖體多肽合成酶（NRPSs）由一系列的模塊構成，其中的氨基酸腺苷化結構域（A domain）能特異性識別和激活氨基酸底物，在非核糖體多肽合成中起著關鍵性作用。

海洋放線菌Salinispora arenicola CNS-205基因組測序結果表明， 在5 786 361 bp 的環(huán)狀染色體中分布有10個NPRS相關基因簇，sare0357基因屬于10個基因簇中的SA nrps1 （sare0345-0367）[1-2]。sare0357基因在NCBI上被假定為NRPS腺苷化結構域基因。筆者選取海洋放線菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS A domain基因sare0357，對其進行克隆表達和功能鑒定，能豐富洋放線菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS腺苷化結構域的底物特異性和密碼子領域的研究，同時也可為組合生物學和體外酶系合成NRPs提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1

菌株、質粒。

稀有海洋放線菌Salinispora arenlocola CNS205試驗菌株為華中師范大學結構生物學實驗室保存。

表達載體（pET28-a、pGEX-KG）、表達質粒和感受態(tài)細菌（E.coli DH5α、E.coli BL21）為安慶醫(yī)藥高等?？茖W院實驗室保存。

1.1.2

主要試驗儀器。凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司;高速冷凍離心機，核酸蛋白質分析儀，均為德國Eppendorf公司;熒光多功能酶標儀，美國Bio-Tek公司。

1.1.3

蛋白的表達和純化。 蛋白的表達和純化見文獻[3]。

1.2 Sare0357復性蛋白的酶活測定

采用2009年Thomas J. McQuade等報道的孔雀石綠鉬酸銨化學顯色定磷法檢測Sare0357梯度濃度透析復性的成功與否并同時測定Sare復性蛋白的酶活。

1.2.1

Sare0357復興蛋白底物特異性篩選。選取20種常見氨基酸為底物，于96孔板中進行Sare0357復興蛋白底物特異性篩選，反應體系為100 μl（表1），設定沒有加入Sare0357復性蛋白的反應體系為對照組，通過比較不同氨基酸體系下Sare0357復性蛋白的相對活性，得出Sare0357復性蛋白的底物特異性。

表1 100 μl的反應體系組分

反應體系的加入順序依次為氨基酸、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、Sare0357復性蛋白、無機焦磷酸酶、ATP。最后加入ATP時反應開始，25 ℃孵育5 min后加入孔雀石綠鉬酸銨顯色劑100 μl使反應終止。反應終止后將96孔板置于30 ℃下10 min進行顯色反應，反應產物在620 nm處有最大吸光值，通過酶標儀檢測其620 nm處的吸光值。

1.2.2

基本酶動力學參數的測定。（1） PPi標準曲線的測定。以PPi為底物，于96孔板中進行PPi標準曲線的測定（表2 ），反應體系為100 μl。

表2 PPi標準曲線的測定

反應體系的加入順序依次為PPi、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、無機焦磷酸酶。最后加入無機焦磷酸酶時反應開始，25 ℃孵育2 min后加入孔雀石綠鉬酸銨顯色劑100 μl使反應終止。反應終止后將96孔板置于30 ℃下10 min進行顯色反應，反應產物在620 nm處有最大吸光值，通過酶標儀檢測其620 nm處的吸光值。

以PPi濃度為橫軸，酶標儀測得的620 nm處的吸光值為縱軸，即可繪制出PPi標準曲線。

（2）ATP自水解曲線的測定。于96孔板中進行ATP自水解曲線的測定（表3），反應體系為100 μl。

表3 ATP自水解曲線的測定

反應體系的加入順序依次為氨基酸、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、無機焦磷酸酶、ATP。最后加入ATP時反應開始，25 ℃分別孵育2、4、6、8 min后加入孔雀石綠鉬酸銨顯色劑100 μl使反應終止。反應終止后將96孔板置于30 ℃下10 min進行顯色反應，反應產物在620 nm處有最大吸光值，通過酶標儀檢測其620 nm處的吸光值。

以反應體系孵育時間為橫軸，酶標儀測得的620 nm處的吸光值為縱軸，即可繪制出ATP自水解曲線。

（3）酶促反應初速度范圍的測定。分別以苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）為底物，于96孔板中進行酶促反應初速度范圍的測定（表4），反應體系為100 μl。

反應體系的加入順序依次為Phe/Trp、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、不同濃度的Sare0357復性蛋白、無機焦磷酸酶、ATP。最后加入ATP時反應開始，25 ℃分別孵育2、4、6、8 min后加入孔雀石綠鉬酸銨顯色劑100 μl使反應終止。反應終止后將96孔板置于30 ℃下10 min進行顯色反應，反應產物在620 nm處有最大吸光值，通過酶標儀檢測其620 nm處的吸光值。

表4 酶促反應初速度范圍的測定

對反應體系孵育時間和PPi的生成量作非線性回歸分析，繪制時間-進程曲線，線性范圍內，生成PPi量最大的酶濃度即為酶的最佳反應濃度。

對反應體系中酶濃度和PPi的生成速率作非線性回歸分析，繪制酶濃度-PPi生成速率曲線，線性范圍內，最大PPi生成速率的孵育時間即為最適孵育時間。

（4）目的蛋白基本酶動力學參數的確定。

在（3）酶促反應初速度范圍測定得到的酶促反應的最適酶濃度和最佳孵育時間條件下，分別以Phe、Trp為底物，于96孔板中進行目的蛋白基本酶動力學參數的測定（表5 ），反應體系為100 μl。

表5 目的蛋白基本酶動力學參數的確定

反應體系的加入順序依次為不同濃度的Phe/Trp、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、Sare0357復性蛋白、無機焦磷酸酶、ATP。最后加入ATP時反應開始，25 ℃分別孵育2 min后加入孔雀石綠鉬酸銨顯色劑100 μl使反應終止。反應終止后將96孔板置于30 ℃下10 min進行顯色反應，反應產物在620 nm處有最大吸光值，通過酶標儀檢測其620 nm處的吸光值。

以反應體系Phe/Trp濃度為橫軸，生成PPi的速率為縱軸，通過非線性回歸分析，擬合米氏方程曲線并求得酶動力學參數（Km、Vmax、kcat）。

2 結果與分析

采用Thomas J. McQuade等新建的一種孔雀石綠鉬酸銨化學顯色定磷法進行高通量篩選和測定A結構域的酶活[4]。此法綜合了酶偶聯(lián)法（偶聯(lián)無機焦磷酸酶）、化學顯色法及光吸收法，能夠快速準確地對Sare0357復性蛋白進行酶活測定。

通過高通量篩選的孔雀石綠鉬酸銨化學顯色定磷法，Sare0357復性蛋白對20種常見氨基酸的活性見圖1。相較于其他18種氨基酸，以Phe/Trp為底物時，Sare0357復性蛋白酶促反應的顯色結果較為明顯，其中，又以Trp為底物時，Sare0357復性蛋白酶促反應的顯色結果最深，呈黃綠色。

通過酶標儀可測得以20種常見氨基酸為底物時，孔雀石綠鉬酸銨化學顯色定磷法顯色后反應產物在620 nm處的吸光值，由此可得到Sare0357復性蛋白對20種常見氨基酸的相對活性的比較。圖2與圖1所示結果相符，相較于其他18種氨基酸，以Phe/Trp為底物時，顯色后反應產物在620 nm處的吸光值較大，Sare0357復性蛋白的相對活性較高;其中，又以Trp為底物時，顯色后反應產物在620 nm處的吸光值最大，Sare0357復性蛋白的相對活性最高。由此可得，20種常見氨基酸中，Phe/Trp為Sare0357復性蛋白特異性識別底物。其中Sare0357復性蛋白識別Trp的底物特異性大于Sare0357復性蛋白識別Phe的底物特異性。

注：Control：不含Sare0357變性蛋白的陰性對照組（含Trp）Trp、Phe;1～9. Gly、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met、Gin;10～18. Asp、Glu、Arg、Lys、His、Pro、Asn、Tyr、Ala。

圖1 孔雀石綠鉬酸銨化學顯色定磷法篩選Sare0357復性蛋白的底物特異性

注：將Sare0357復性蛋白對Trp的活性值記作100%。

圖2 Sare0357復性蛋白對20種常見氨基酸的相對活性

以PPi為底物，于96孔板中進行PPi標準曲線的測定，以未添加氨基酸、Sare0357復性蛋白以及ATP的反應體系測定PPi標準曲線。25 ℃孵育2 min后加入孔雀石綠鉬酸銨顯色劑100 μl使反應終止。反應終止后將96孔板置于30 ℃下10 min進行顯色反應，通過酶標儀檢測反應產物在620 nm處的吸光值。以PPi濃度為橫軸，酶標儀測得的620 nm處的吸光值為縱軸，即可繪制出PPi標準曲線，結果見圖3。

圖3 PPi標準曲線

于96孔板中進行ATP自水解曲線的測定，以未添加Sare0357復性蛋白的反應體系測ATP自水解曲線。25 ℃分別孵育2、4、6、8 min后加入孔雀石綠鉬酸銨顯色劑100 μl使反應終止。反應終止后將96孔板置于30 ℃下10 min進行顯色反應，通過酶標儀檢測反應產物在620 nm處的吸光值。以反應體系孵育時間為橫軸，酶標儀測得620 nm處的吸光值為縱軸，即可繪制出ATP自水解曲線，結果見圖4。

圖4 ATP自水解曲線

分別以苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）為底物，于96孔板中進行酶促反應初速度范圍的測定，向100 μl的反應體系中依次加入Phe/Trp（0.5 mmol/L）、10%甘油（V/V）、50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、DTT（1 mmol/L）、MgCl2（10 mmol/L）、不同濃度的Sare0357復性蛋白（0.100、0.125、0.150、0.200、0.250、0.300 μmol/L）、無機焦磷酸酶（0.4 U/ml）、ATP（0.5 mmol/L）。25 ℃分別孵育2、4、6、8 min后加入孔雀石綠鉬酸銨顯色劑100 μl使反應終止。反應終止后將96孔板置于30 ℃下10 min進行顯色反應，反應產物在620 nm處有最大吸光值，通過酶標儀檢測其620 nm處的吸光值。

對孵育時間和PPi的生成量作非線性回歸分析，繪制時間-進程曲線，結果見圖5。由圖5 A可知，以Trp為底物，

僅當Sare0357復性蛋白≤0.15 μmol/L時，生成PPi的量與孵育時間呈線性遞增關系，且在Sare0357復性蛋白濃度為0.15 μmol/L時達到最大反應產物生成速率，由此可知，Trp為底物時，酶促反應的最適酶濃度，即反應體系中Sare0357復性蛋白最適濃度為0.15 μmol/L。同時根據圖5 C可知，以Phe為底物，僅當Sare0357復性蛋白≤0.15 μmol/L時，生成PPi的量與孵育時間呈線性遞增關系，且在Sare0357

復性蛋白濃度為0.15 μmol/L時達到最大反應產物生成速率，由此可知，以Phe為底物時，酶促反應的最適酶濃度，即反應體系中Sare0357復性蛋白最適濃度為0.15 μmol/L。

對 Sare0357復性蛋白濃度和PPi的生成速率作非線性回歸分析，繪制酶濃度-生成速率曲線，結果見圖5。由圖5B可知，Trp為底物時，只有將孵育時間控制在2 min以內，PPi產物生成速率與酶濃度才能保持線性遞增關系，且孵育2 min可達到最大產物生成速率。所以，Trp為底物時，酶促反應的最佳孵育時間為2 min。由圖5D可知，Phe為底物時，只有將孵育時間控制在2 min以內，不同酶濃度下的PPi產物生成速率與酶濃度才能保持線性遞增關系，且孵育2 min可達到最大產物生成速率。所以，Phe為底物時，酶促反應的最佳孵育時間為2 min。

綜上可知，無論是Trp還是Phe為底物，酶促反應的最

注：A、 C. 時間進程曲線，以PPi生成量對孵育時間作線性擬合（A為Trp底物下的時間進程曲線，C為Phe底物下的時間進程曲線）。B、 D. 酶濃度曲線，以PPi生成速率對Sare0357復性蛋白濃度作線性擬合（B為Trp底物下的時間進程曲線，D為Phe底物下的酶濃度曲線）。

圖5 最佳孵育時間和最適酶濃度的確定

適酶濃度為0.15 μmol/L，最佳孵育時間為2 min。

在酶促反應最適酶濃度和最佳孵育時間條件下，分別以Phe、Trp為底物，測定不同丙氨酸濃度進行酶促反應時PPi 的生成速率。

以反應體系Phe/Trp濃度為橫軸，生成PPi的速率為縱軸，通過非線性回歸分析，擬合米氏方程曲線（圖6），并求得酶動力學參數（Km、Vmax、kcat）。Sare0357復性蛋白對Trp的酶動力學參數為：Km=（0.040 33±0.003 67）mmol/L，Vmax=（2.135 05±0.029 43）μmol/（L·min），Kcat=（14.233 6±0.196 2）min;Sare0357復性蛋白對Phe的酶動力學參數為：Km= （0.027 65 ±0.001 51）mmol/L，Vmax=（1.558 06±0.009 7）μmol/（L·min），Kcat=（10.387 1 ±0.064 6）min。

注：A.Trp為底物時，Sare0357復性蛋白酶動力學參數的測定;B.Phe為底物時，Sare0357復性蛋白酶動力學參數的測定。

圖6 Sare0357復性蛋白酶動力學參數的測定

3 討論

該研究對Sare0357復性蛋白酶活測定結果顯示Sare0357復性蛋白具有Trp和Phe底物特異性，能識別并活化Trp和Phe參與NRP的合成，是Trp和Phe特異性的NRPS腺苷化結構域蛋白。而生物信息學預測結果顯示，Sare0357蛋白氨基酸序列標簽為DARSVSQMTK，無相應預測底物，與試驗結果不符。實際上，基于一直以來對A domain的大量研究工作，盡管利用生物信息學可以較準確地進行A domain底物特異性的預測，但縱觀近年海洋放線菌NRPS腺苷化結構域底物特異性研究，不難發(fā)現A結構域預測底物與實際徼活氨基酸底物并不匹配的報道。如SCHULTZ等[2]對cymA（S.arenicola CNS-205 Cyclomarin生物合成基因簇基因）采取生物信息學手段進行底物特異性分析，預測結果表明cymA的7個腺苷化結構域中有6個無匹配底物，而試驗結果表明這6個預測結果表明沒有匹配底物的腺苷化結構域基因表達產物均有相對應的特異性底物識別[2]。

實際上，現有的MALDONADO等[5]、STACHELHAUS等[6]建立的A domain底物特異性密碼子數據庫的試驗數據幾乎全部來源于陸生菌屬。而海、陸兩地放線菌在生理學和種系發(fā)育上顯著差異可能造成了海洋放線菌A domain底物特異性預測的不準確性。由此可見，海洋放線菌作為一個全新的系統(tǒng)，需要建立其獨特的A domain底物特異性“密碼子”數據庫。目前對于海洋放線菌NRPS腺苷化結構域的研究積累還不夠，需要大量的試驗數據來建立海洋放線菌NRPS A doamin底物特異性密碼子數據庫，并在此數據庫基礎上開發(fā)、建立更為準確可靠的海洋放線菌NRPS A doamin底物特異性生物信息學預測方法。

參考文獻

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[3] 陸勝利，祁超.海洋放線菌對S.areniocola CNS-205腺苷化結構域基因的克隆、表達和純化[J].華中師范大學學報：自然科學版，已接受。

[4] MCQUADE T J，SHALLOP A D，SHEORAN A，et al.A nonradioactive high-throughput assay for screening and characterization of adenylation domains for nonribosomal peptide combinatorial biosynthesis[J].Anal Biochem，2009，386（2）：244-250.

[5] MALDONADO L A，FENICAL W，JENSEN P R，et al.Salinispora arenicola gen.nov.，sp.nov.and Salinispora tropica sp.nov.，obligate marine actinomycetes belonging to the family Micromonosporaceae[J].Int J Syst Evol Microbiol，2005，55（5）：1759-1766.

[6] STACHELHAUS T，MOOTZ H D，MARAHIEL M A.The specificity-conferring code of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases[J].Chem Biol，1999，6（8）：493-505.