吳建忠 王玉蘋 許源媛 劉巖 趙茜

摘要 [目的] 得到清晰的特異性條帶，更好地分析SRAP標(biāo)記產(chǎn)物。[方法]對(duì)聚丙烯酰胺電泳的上樣量、電壓條件進(jìn)行了梯度試驗(yàn)，同時(shí)就灌膠方式、銀染時(shí)間、顯影劑調(diào)配等各步驟的操作進(jìn)行了詳細(xì)地探討。[結(jié)果] 上樣量7 μl、電壓1 000 V最合適，能得到 DNA條帶清晰、特異性條帶區(qū)分效果明顯的條帶。 [結(jié)論] 為后續(xù)電泳操作及分析過(guò)程奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 亞麻;聚丙烯酰胺凝膠電泳;銀染

中圖分類號(hào) S563.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11636-02

Considerations for Study in Polyacrylamide Gel Electrophoresis Process

WU Jian-zhong1， WANG Yu-ping2， XU Yuan-yuan2 et al

（1. Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin， Heilongjiang 150086;2. College of Life Sciences of Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150025）

Abstract [Objective] The aim was to get clear specific bands， in order to better analyze SRAP markers. [Method] Sample amount and voltage condition of polyacrylamide electrophoresis were tested.at the same time， glue， silver dyeing time， the developer deployment and so on were made a detail discussion on the operation of the flash. [Result] 7 μl of sample amount， 1 000 V of voltage was the most appropriate， and could get clear DNA banding and specificity belt to distinguish the effect of belts. [Conclusion] The study laid a solid technical foundation for convenient operation and subsequent analyses process.

Key words Flax; Polyacrylamide gel electrophoresis; Silver staining

基金項(xiàng)目 哈爾濱市科技創(chuàng)新工程青年基金項(xiàng)目（2013RFQYJ010）;黑龍江省農(nóng)科創(chuàng)新青年基金項(xiàng)目（2012QN009）;國(guó)家農(nóng)業(yè)部科技支撐計(jì)劃基金項(xiàng)目（2013BAD01B03）。

作者簡(jiǎn)介 吳建忠（1983- ），男，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，助理研究員，在讀博士，從事作物遺傳育種方面的研究。

收稿日期 2014-10-20

聚丙烯酰胺凝膠電泳是由Raymond和Weintraub于1959年利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)創(chuàng)建的一種電泳方式，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代[1]。聚丙烯酰胺凝膠電泳在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，被人們稱為是對(duì)生物大分子進(jìn)行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段，即“Last Check”。 聚丙烯酰胺凝膠具有可分離不同分子量的生物大分子、靈敏度高、化學(xué)惰性好、重復(fù)性好、透明度好等優(yōu)點(diǎn)，目前尚無(wú)更好地支持介質(zhì)能夠取代它[2]，但其不足之處在于操作過(guò)程繁瑣[3]。SRAP標(biāo)記在亞麻基因型分析中使用普遍，該標(biāo)記方法能產(chǎn)生大量特異性條帶[4]，為了得到清晰的特異性條帶，更好地分析SRAP標(biāo)記產(chǎn)物，必須注意操縱過(guò)程中的每一個(gè)細(xì)節(jié)。筆者在亞麻SRAP標(biāo)記分析中，對(duì)聚丙烯酰胺電泳的上樣量、電壓條件進(jìn)行了梯度試驗(yàn)，同時(shí)就灌膠方式、銀染時(shí)間、顯影劑調(diào)配等各步驟的操作作了詳細(xì)地探討，為SRAP標(biāo)記后續(xù)亞麻基因型分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。

供試植物材料均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供，采用改良過(guò)的 CTAB 法提取亞麻全基因組 DNA[5]，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度分析純度后，置于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 化學(xué)試劑。

丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺、硫酸銨、尿素、硼酸、TRIS-base、EDTA、TEMED、75%乙醇、親和硅烷、玻璃硅烷、硝酸銀、氫氧化鈉、無(wú)水碳酸鈉、甲醛、去離子水，其他用試劑純。

1.2 方法

采用已經(jīng)建立并優(yōu)化的SRAP標(biāo)記技術(shù)體系進(jìn)行亞麻PCR擴(kuò)增點(diǎn)樣基因型分析[6-7]。

對(duì)面板和背板分別擦板后，采用適量6%PAGE溶液灌膠，制作膠板。點(diǎn)樣前先80 W預(yù)熱30 min，60 W進(jìn)行正式電泳80 min。用質(zhì)量濃度0.3%的硝酸銀溶液銀染8 min，取出后用去離子水沖洗3遍，每次1 min;再置于顯影液（由2%NaOH、0.06%NaHCO3、4.4%HCHO混合而成的）中，時(shí)間約為5 min，以DNA條帶清晰可辨為準(zhǔn)，取出后用去離子水漂洗3遍，每次3 min，瀝干，在觀察燈下人工讀帶、記錄，并照相留底。

2 結(jié)果與分析

2.1 上樣量梯度分析

上樣量分別為4、7、10 μl，檢測(cè)不同上樣量對(duì)電泳結(jié)果產(chǎn)生的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 上樣量影響

由圖1可知，不同上樣量對(duì)電泳結(jié)果產(chǎn)生影響。上樣量4 μl時(shí)，DNA條帶顏色淡，易缺帶，影響讀帶;上樣量7 μl時(shí)，DNA條帶清晰，顏色深，易讀帶;上樣量10 μl時(shí)，DNA條帶清晰度、顏色深淺與上樣量為7 μl時(shí)基本一致。因此上樣量為7 μl最合適，用最少的上樣量得到最清晰的電泳結(jié)果以避免浪費(fèi)樣品。

點(diǎn)樣孔內(nèi)充滿緩沖液，若上樣量為4 μl，樣品體積相對(duì)點(diǎn)樣孔內(nèi)緩沖液的體積小，點(diǎn)樣時(shí)樣品受到緩沖液的阻力大，易被擋在點(diǎn)樣孔外，樣品不易進(jìn)入點(diǎn)樣孔或者全部被緩沖液擋在點(diǎn)樣孔外，結(jié)果出現(xiàn)DNA條帶顏色淺或者缺帶現(xiàn)象;若上樣量為10 μl，樣品進(jìn)入點(diǎn)樣孔時(shí)所受阻力相對(duì)較小，易進(jìn)入點(diǎn)樣孔。由于阻力依然存在，一部分樣品被留在點(diǎn)樣孔外，污染緩沖液，這部分樣品還易落入相鄰點(diǎn)樣孔內(nèi)，造成竄樣，影響讀帶;若上樣量為7 μl，樣品可以全部進(jìn)入點(diǎn)樣孔，不會(huì)被留在點(diǎn)樣孔外。

2.2 電壓梯度分析

設(shè)置電壓分別為600、800和1 000 V，檢測(cè)不同電壓值對(duì)電泳結(jié)果的產(chǎn)生影響，不同電壓條件下的電泳圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 電壓梯度分析

由圖2可知，3種電壓條件下所得到的電泳結(jié)果基本一致，DNA條帶直，顏色深，清晰可辨。雖然3種電壓對(duì)電泳圖譜影響不明顯，但DNA條帶電泳至同一位置所耗時(shí)不同。DNA條帶電泳至玻璃板的3/4處，電壓1 000 V需要1.5 h，電壓800 V需要2.5 h，而電壓600 V則需要3 h以上。為了縮短試驗(yàn)時(shí)間，選擇電壓1 000 V最合適。

3 討論

在聚丙烯酰胺凝膠電泳操作過(guò)程中，電泳結(jié)果受到諸多因素的影響。正確的灌膠方式可以避免氣泡的產(chǎn)生，若膠內(nèi)有氣泡，會(huì)使DNA帶彎曲，影響成像美觀。當(dāng)氣泡位于點(diǎn)樣孔內(nèi)，DNA所受到的阻力小，其電泳速度比其他DNA快，導(dǎo)致DNA帶彎曲。氣泡位置及大小不同，DNA帶彎曲程度也不同：氣泡位于DNA電泳路徑內(nèi)，氣泡越大，氣泡長(zhǎng)度與路徑長(zhǎng)度的比值越大，DNA彎帶曲程度越大。氣泡越小，氣泡長(zhǎng)度與路徑長(zhǎng)度的比值越小，DNA帶彎曲程度越小;氣泡位于DNA電泳路徑外，DNA在其電泳路徑內(nèi)所受阻力基本相同，DNA帶不彎曲，可視為無(wú)影響。點(diǎn)樣孔內(nèi)的氣泡，灌膠時(shí)易產(chǎn)生，插入梳子時(shí)也易帶入。如果整個(gè)聚丙烯酰胺凝膠薄厚不均或點(diǎn)樣孔處的膠發(fā)生下移，會(huì)導(dǎo)致整條DNA帶不再一條水平線上。這是由于膠液下移導(dǎo)致的，只需灌膠后，調(diào)整玻璃板與水平臺(tái)即可。

若DNA條帶顏色淺或DNA條帶顏色與背景色差別小，會(huì)影響讀帶。銀染和顯影過(guò)程中一些細(xì)節(jié)需要注意。銀染液由5 g硝酸銀、1 500 ml去離子水調(diào)配而成。用搖床搖15～30 min后即可使用。若時(shí)間少于15 min，硝酸銀沒(méi)有完全溶解，銀染效果不好。銀染時(shí)間為8 min左右，少于8 min，銀染不徹底，DNA條帶顏色淺;多于15 min，銀離子富集在膠內(nèi)，顯影時(shí)面板會(huì)全部變黑，無(wú)法讀帶。顯影液由0.9 g無(wú)水碳酸鈉、30 g氫氧化鈉、6 ml甲醛、1 500 ml去離子水配置而成。甲醛現(xiàn)用現(xiàn)加，加入甲醛后，在搖床上搖2 min后即可使用。如果甲醛沒(méi)有搖勻，顯影時(shí)局部高濃度的甲醛迅速還原銀離子，局部面板變黑，DNA條帶和背景顏色一樣深，無(wú)法讀帶。若提前加入甲醛，甲醛在空氣中易揮發(fā)，實(shí)際操作時(shí)溶液中甲醛濃度不夠，影響顯影效果。若加入甲醛較晚，依然由于甲醛濃度分布不均引起局部膠面迅速變黑，無(wú)法讀帶。若不加甲醛，由于缺少還原銀離子的還原劑，DNA條帶不會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)。甲醛是具有特殊刺激性氣味的液體，對(duì)人體有強(qiáng)烈的致癌和促癌作用，在嗅覺(jué)、過(guò)敏，肝、肺、免疫功能等方面也有影響，顯影過(guò)程必須在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，使空氣中的甲醛及時(shí)排到室外，減少對(duì)人體的危害[8]。面板染色不均勻，與銀染液和顯影液的使用次數(shù)有關(guān)，由于重復(fù)使用，銀染液中銀離子濃度降低，銀染液內(nèi)殘留膠塊和DNA染色劑，影響銀染效果。為了避免染色不均，銀染液和顯影液一般在使用3次后重新配制。

若膠面脫落或損壞，導(dǎo)致數(shù)據(jù)缺失，原因有2個(gè)：一是親和硅烷和玻璃硅烷擦得不均勻，導(dǎo)致面板與背板不易分開，若用力撬開，膠面可能脫離面板，粘到背板上，也可能從膠中間分開，粘到2個(gè)板上。若膠粘到背板上，由于膠面缺失，不僅損失部分?jǐn)?shù)據(jù)，也影響成像美觀;若膠粘到2個(gè)板上，在面板上的膠由于表面凹凸不平，銀染時(shí)就會(huì)由于銀離子大量進(jìn)入而導(dǎo)致顏色變深，顯影時(shí)不僅會(huì)迅速變黑，而且影響其周圍1 cm范圍內(nèi)的膠也變黑，無(wú)法讀帶，所損失的數(shù)據(jù)范圍比粘掉的膠面面積大;二是顯影后，去離子水沖洗不徹底。顯影液中含有氫氧化鈉，若膠內(nèi)殘留氫氧化鈉，膠面易脫落。因此，為使膠面完整，在擦板時(shí)，親和硅烷和玻璃硅烷可以均擦2遍，顯影后，漂洗時(shí)間一定要長(zhǎng)，防止氫氧化鈉殘留，腐蝕膠面[9]。

若同一水平線上的DNA條帶，形狀顏色都一致，只有一條DNA條帶長(zhǎng)度是其他DNA條帶長(zhǎng)度的50%，很難判斷這半條帶的準(zhǔn)確性，因?yàn)楹苡锌赡苁歉Z樣造成的，需要進(jìn)一步判斷。為防止竄樣，點(diǎn)樣時(shí)，不同樣品要更換槍頭。由于用不同引物擴(kuò)增DNA，所以PCR產(chǎn)物中DNA濃度不同，若樣品內(nèi)DNA濃度高，會(huì)產(chǎn)生一條顏色淺、凝膠狀的雜帶，DNA在這里凝聚導(dǎo)致條帶無(wú)法分開，影響讀帶，上樣量為7 μl可有效防止雜帶的產(chǎn)生。

若凝膠時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)增加試驗(yàn)耗時(shí)。配膠時(shí)，10%AP與TEMED用量越多，膠凝固速度越快。在50 ml PAGE溶液中分別加750 μl和75 μl的AP、TEMED，凝膠時(shí)間僅需5 min;若分別加入450 μl和45 μl的AP、TEMED，凝膠時(shí)間需要30 min以上，因此，可以根據(jù)用時(shí)調(diào)整兩者用量。

4 結(jié)論

聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高，能分辨分子量較小的DNA片段，但其操作步驟多，用時(shí)長(zhǎng)，因此每個(gè)操作細(xì)節(jié)都會(huì)影響最終成像結(jié)果。只有注意每個(gè)操作步驟，才能使DNA條帶清晰、特異性條帶區(qū)分效果明顯，從而得到準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果，為研究DNA分子標(biāo)記分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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