林源 王志昇 李勇 劉河濤 何生虎

摘要 [目的]研究披針葉黃華生物堿的具體種類及含量。[方法]采用生物堿系統(tǒng)提取、硅膠柱層析分離及重結(jié)晶技術(shù)從披針葉黃華干草粉中分離生物堿，并用GC-MS對(duì)總堿和結(jié)晶進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果]分離出2種生物堿結(jié)晶Ⅰ和結(jié)晶Ⅱ，總堿中含有7種喹諾里西啶生物堿，結(jié)晶Ⅰ為黃華堿，結(jié)晶Ⅱ?yàn)門(mén)etrahydrodeoxoargentamin。[結(jié)論]該試驗(yàn)為進(jìn)一步研究披針葉黃華動(dòng)物中毒的毒性毒理提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 披針葉黃華;生物堿;成分分析

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11660-02

Analysis on the Contents of Alkaloid in Thermopsis lanceolate

LIN Yuan1， WANG Zhi-sheng1， LI Yong2，HE Sheng-hu3* et al

（1. Ningxia Medical University， Yinchuan，Ningxia 750021; 2. Ningxia Polytechnic，Yinchuan，Ningxia 750021; 3.Ningxia University， Yinchuan，Ningxia 750021）

Abstract [Objective] The research aimed to study the specific types and contents of alkaloids in Thermopsis lanceolate. [Method]Alkaloid crystal was isolated from Thermopsis lanceolate powder by silica gel column and recrystal technology. The total alkaloids and crystallization were further determined by GC-MS. [Result]Two kinds alkaloid of crystalline Ⅰ and crystalline Ⅱ were isolated.The total alkaloids containing 7 kinds Kui Nuolixi Ding alkaloid， that crystal I is d-Thermopsine and crystal II is Tetrahydrodeoxoargentamin. [Conclusion] This experiment provides the theoretical basis for funther research on toxicity and toxicology of Thermopsis lanceolate-poisoning animal.

Key words Thermopsis lanceolate;Alkaloid;Contents analysis

作者簡(jiǎn)介 林源（1982- ），男，寧夏銀川人，講師，博士，從事天然藥物及基因工程藥物研究。*通訊作者，教授，碩士，博士生導(dǎo)師，從事家畜內(nèi)科學(xué)疾病和有毒植物研究。

收稿日期 2014-10-17

披針葉黃華（Thermopsis lanceolate），又稱牧馬豆或土馬豆，屬豆科野決明屬，多年生草本植物。分布于我國(guó)的東北、華北、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆、四川等省區(qū)，俄羅斯、蒙古也有分布。本種即是一種有毒植物[1]，牲畜誤食種子或全草后會(huì)引起中毒;但其可作為一種藥用植物，具有興奮呼吸、抗輻射及祛痰止咳等功效。引起披針葉黃華中毒的成分主要是喹諾里西啶生物堿類，已報(bào)道的有黃花堿、臭豆堿、金雀花堿、d-鷹爪豆堿、羽扇豆堿、N-甲基金雀花堿、N-甲醛基金雀花堿等，該類生物堿具有抗癌、抗心率失調(diào)、抗微生物、抗?jié)兒蜕甙准?xì)胞等多方面的藥理作用[2]，具有潛在的藥用價(jià)值。筆者在此采用生物堿系統(tǒng)提取、硅膠柱層析分離及重結(jié)晶技術(shù)從披針葉黃華干草粉中分離生物堿，并用GC-MS對(duì)總堿和結(jié)晶進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料。

披針葉黃華于2006年10月采自寧夏鹽池縣，洗凈、曬干、粉碎后備用。黃華堿、金雀花堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，規(guī)格為20 mg。

1.1.2 主要儀器。

島津GC-MSQP2010氣質(zhì)聯(lián)用分析儀，美國(guó)惠普公司;AR1140電子天平，美國(guó)制造; 2XZ-2旋片式真空泵，浙江黃巖求精真空泵廠生產(chǎn);RE52-05型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;Db-2型不銹鋼電熱板，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

1.1.3 試劑。薄層層析硅膠GF254，青島海洋化工有限公司;柱層層析用硅膠，批號(hào)01284304，青島海洋化工廠分廠。所用試劑和藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純和AR級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 披針葉黃華總堿的提取。

85%酒精加熱回流提取，濃縮提取液得浸膏。用1N HCl溶解后氯仿除雜，氨水堿化至pH為9～11后氯仿萃取[3-4]。

1.2.2 總堿的薄層層析。

總生物堿、黃華堿、金雀花堿用甲醇溶解，再用毛細(xì)管點(diǎn)樣于硅膠板上，乙酸乙脂-甲醇做展開(kāi)劑，上行法展開(kāi)[5]。展開(kāi)劑跑至距硅膠板前沿1～2 cm處時(shí)取出，揮干溶劑。置于 254 nm紫外燈下觀察熒光，再用改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色，計(jì)算各點(diǎn)比移值（Rf）值。

1.2.3 總堿的柱層析分離。

稱取15 g總堿，用甲醇溶解后與柱層析硅膠按1∶1（g/g）進(jìn)行拌樣，將拌好的樣品揮干，研細(xì)備用。用石油醚裝柱，采用濕法裝柱、干法上樣方法將處理好的樣品上于硅膠柱[6-7]。洗脫液選用乙酸乙脂-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，梯度順序?yàn)橐宜嵋抑宜嵋抑眉状迹?2∶1、6∶1、3∶1、1∶1、1∶2）→甲醇。每15 ml收集1份。乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）做展開(kāi)劑進(jìn)行TLC檢測(cè)，合并相同組分，待其自然揮干，收集管壁析出晶體，并重結(jié)晶進(jìn)行純化。

1.2.4 氣相-質(zhì)譜（Gas chromatograph-Mass spectrum，GC-MS）分析。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品、提取的總堿、結(jié)晶Ⅰ、結(jié)晶Ⅱ進(jìn)行GC-MS分析[8]。各樣品用甲醇溶解，進(jìn)樣量1 μl。

1.2.4.1 色譜條件。采用GC-MSQP2010氣質(zhì)聯(lián)用分析儀，GC-MS接口溫度280 ℃，檢索譜庫(kù)為DB-5MX。

1.2.4.2 GC條件。色譜柱HP-SE-54石英玻璃毛細(xì)管柱（甲基硅氧烷，0.25 mm×30 m），載氣He，分流比20∶1，柱溫190～280 ℃，程序升溫5 ℃/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，用峰面積歸一法計(jì)算各化合物的相對(duì)百分含量。

1.2.4.3 MS條件。EI離子源，電子能量70 ev，離子源溫度230 ℃，倍增器電壓0.7 kV，質(zhì)量掃描范圍40～400 u，掃描周期0.5 s。DB-5MX質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 披針葉黃華生物堿提取結(jié)果

對(duì)5組提取試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算得出乙醇提取浸膏量為93.4 g/kg，總生物堿量為3.82 g/kg，披針葉黃華中生物堿的提取率平均為0.38%。

2.2 總生物堿薄層層析檢查結(jié)果

總生物堿薄層層析以乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）做展開(kāi)劑分離效果最好，可以看到8個(gè)點(diǎn)，其中5個(gè)點(diǎn)清晰明顯且比較集中，2個(gè)點(diǎn)模糊。根據(jù)薄層層析結(jié)果（表1）判定披針葉黃華生物堿至少含有5種以上不同生物堿。

表1 總生物堿薄層層析檢查結(jié)果

注：*表示該點(diǎn)不明顯。

2.3 總堿柱層析分離結(jié)果

共收集244管洗脫液，經(jīng)TLC檢測(cè)合并Rf相同的試管。13～24管管壁有淡黃色片狀結(jié)晶，試管底部為褐色油狀物和結(jié)晶混合物，TLC檢測(cè)出現(xiàn)3點(diǎn);187～223管管壁有大量長(zhǎng)絲狀黃色結(jié)晶、TLC檢測(cè)出現(xiàn)1點(diǎn)。共收獲2種結(jié)晶，命名為結(jié)晶Ⅰ和結(jié)晶Ⅱ，結(jié)晶Ⅰ經(jīng)甲醇重結(jié)晶后為淡黃色片裝結(jié)晶，結(jié)晶Ⅱ經(jīng)丙酮重結(jié)晶為針狀淡黃色結(jié)晶。

2.4 GC-MS檢測(cè)結(jié)果

總堿經(jīng)GC-MS分析，共出峰24個(gè)，總離子流色譜圖如圖1所示，經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定了7種生物堿成分（表2）。在總堿中首次測(cè)得了生物堿Tetrahydrodeoxoargentamin ，其余6種生物堿已見(jiàn)于以往的報(bào)道?？偵飰A總離子流色譜圖結(jié)果（圖1）顯示，總堿中5號(hào)和6

號(hào)生物堿的出峰時(shí)間與金雀花堿和黃華堿標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)

圖1 總生物堿總離子流色譜圖

表2 披針葉黃華總堿GC-MS分析鑒定結(jié)果

間一致;而結(jié)晶I的出峰時(shí)間

與黃華堿相同、結(jié)晶Ⅱ出峰時(shí)間與金雀花堿標(biāo)準(zhǔn)品不同。

結(jié)晶Ⅰ經(jīng)GC-MS檢測(cè)并與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)鑒定為黃華堿，純度達(dá)96%;結(jié)晶Ⅱ經(jīng)GC-MS檢測(cè)為T(mén)etrahydrodeoxoargentamin，純度達(dá)70%，需進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)后確定。總堿中金雀花堿含量很少，僅為0.3%。

3 結(jié)論與討論

（1）寧夏中草藥手冊(cè)記載該植物含生物堿量為0.5%～3.0%，其中莖葉0.79%、根0.76%、種子和花含量較高，分別為2.02%和1.46%。該試驗(yàn)采用醇類溶劑提取法提取披針葉黃華總生物堿，由于原料采用的是全草且采時(shí)已過(guò)開(kāi)花時(shí)期，故草粉中生物堿含量低，提取總堿量?jī)H占全草質(zhì)量的0.38%。另一個(gè)原因是由于披針葉黃華中以大極性生物堿為主，故采用氯仿未能完全萃取出所含生物堿，應(yīng)該繼續(xù)用正丁醇提取殘留生物堿。

（2）總堿薄層層析時(shí)，乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）分離效果最好，在碘化鉍鉀顯色劑下呈現(xiàn)8個(gè)點(diǎn)。但在GC-MS分析中，儀器所檢測(cè)并確定的物質(zhì)只有7種，含量最小的生物堿僅占總堿的0.3%。因?yàn)闅赓|(zhì)聯(lián)用儀精密度很高，故推測(cè)薄層層析中顯色模糊的點(diǎn)有可能是其他生物堿的脫尾。

（3）經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定的7種生物堿，有6種均為已知的披針葉黃華生物堿[9]，而Tetrahydrodeoxoargentamin未見(jiàn)報(bào)道存在于該植物當(dāng)中，需進(jìn)一步通過(guò)紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）、核磁共振（NMR）來(lái)鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。以往報(bào)道披針葉黃華含量最高的是金雀花堿，約占總堿含量的40%左右[7-8]，而該試驗(yàn)中測(cè)得的金雀花堿僅占總堿的0.3%，可能是受植物采摘季節(jié)、提取部位以及提取分離方法等因素的影響。

參考文獻(xiàn)

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