陳海迪 高旭 張穎 許應天 張立媛 于清洋 魯承

摘要 [目的] 構建表達鵝細小病毒（GPV）VP3基因的重組腺病毒，為機體免疫試驗和免疫效果評價奠定基礎。[方法] 以重組質粒pcDNA-VP3為模板，以GPV-VP3為目的基因，構建GPV-VP3重組腺病毒載體，通過轉染獲得能穩(wěn)定表達GPV-VP3基因的重組腺病毒，通過IFA和Western-blot檢測GPV-VP3基因的表達情況。[結果] 擴增到的GPV-VP3基因全長為1 605 bp，線性化的重組腺病毒穿梭質粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293細胞中瞬時表達GPV-VP3基因，表達蛋白的分子量約為60 Ku。[結論] 該重組腺病毒的構建將為GPV新型疫苗研發(fā)和后期體內試驗奠定基礎。

關鍵詞 鵝細小病毒;VP3基因;重組腺病毒;真核表達

中圖分類號 S852.65+7 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）33-11751-04

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Expressing VP3 Gene of Goose Parvovirus

CHEN Hai-di， GAO Xu， ZHANG Ying et al

（Department of Veterinary Medicine， Agricultural College of Yanbian University， Yanji， Jilin 133002）

Abstract [Objective] The research aimed to construct recombinant adenovirus expressing VP3 gene of goose parvovirus and lay the foundation for making the immunity test and evaluating the immune effects. [Method] Taking recombinant plasmid pcDNA-VP3 as the template， using GPV-VP3 as target gene， the recombinant adenovirus vector of GPV-VP3 was constructed. The recombinant adenovirus that could stably express VP3 gene of goose parvovirus was obtained by transfection. The expression situations of GPV-VP3 were detected by IFA and Western-blot detection. [Result] The complete sequence of amplified GPV-VP3 gene was 1 605 bp. pCR259-VP3 plasmid could transiently express in QBI-HEK293 cells. And the molecular weight of recombinant protein was about 60 Ku. [Conclusion] The construction of recombinant adenovirus laid a foundation for the research and development of a new vaccine of GPV and its experiment in vivo.

Key words Goose parvovirus; VP3 gene; Recombinant adenovirus; Eukaryotic expression

基金項目 吉林省自然科學基金項目（201215230）。

作者簡介 陳海迪（1988- ），女，吉林長春人，碩士研究生，研究方向：動物傳染病分子生物學與免疫學。*通訊作者，副教授，博士，從事動物傳染病分子生物學與免疫學研究。

收稿日期 2014-10-15

鵝細小病毒病（Goose parvovirusis，GP）是由鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的一種雛鵝和雛番鴨最急性、急性、亞急性及高度接觸性傳染病[1]。該病主要侵害雛鵝，病程短，雛鵝發(fā)病后多在1 d左右死亡，根本來不及治療，死亡率高，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]。防治鵝細小病毒病，接種有效的疫苗是關鍵。目前，養(yǎng)鵝業(yè)大多采用傳統(tǒng)疫苗，但存在散毒和滅活不徹底等潛在危險，而基因工程疫苗彌補了傳統(tǒng)疫苗的不足。在眾多基因工程疫苗中，由于活載體疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生持久的體液免疫，可長期抵御外來病原體的侵襲，已成為當今新型疫苗研究的熱點。在活載體疫苗中，腺病毒活載體疫苗因其安全性高、毒性小、宿主范圍廣等特點而受到了廣大科研人員的關注，相關腺病毒活載體疫苗已進入臨床試驗或商品化，并取得了很好的免疫保護效果和經(jīng)濟效益[3]。目前，尚未見到有關GPV重組腺病毒載體疫苗的報道。在GPV 3個結構基因中，VP3基因編碼的衣殼蛋白可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體，使其成為預防GP基因工程疫苗研究的首選靶基因。因此，筆者以改造的腺病毒為載體，以GPV-VP3為目的基因，構建GPV-VP3重組腺病毒載體，通過轉染獲得能穩(wěn)定表達GPV-VP3基因的重組腺病毒，為下一步機體免疫試驗和免疫效果評價奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和菌株

重組質粒pcDNA-VP3由延邊大學動物醫(yī)學系預防獸醫(yī)實驗室構建保存;E.coliJM109和DH5α感受態(tài)細胞購自索萊寶生物科技有限公司;QBI-HEK293細胞和腺病毒穿梭載體pCR259由日本帶廣畜產(chǎn)大學原蟲病中心玄學南教授惠贈。

1.2 主要試劑

FITC標記及HRP標記的羊抗兔IgG，購自Sigma公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、各種限制性內切酶、pMD19-T Simple Vector及DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒等均購自TaKaRa公司;Trizol試劑、Lipofecta mineTM2000轉染試劑盒購自invitrogen公司;其他常規(guī)生化試劑均為分析純。

1.3 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中登錄的GPV-VP3基因序列（AY524421 ），應用Oligo 6.0軟件設計合成了1對特異引物，上游P1：5′-CTCGAGATGGCAGAGGGAGGAG -3′（Xho I），下游P2：5′-CGGTCGACTTACAGATTTTGAGTTAG-3′（Sal I），由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.4 GPV-VP3基因的克隆與鑒定

以重組質粒pcDNA-VP3為模板，以P1與P2為引物，PCR反應體系為50 μl。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，55.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s，30個循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T Simple Vector，構建質粒pMD19T-VP3。將PCR和酶切鑒定均為陽性的質粒送往上海英駿生物技術公司測序。

1.5 重組腺病毒穿梭質粒pCR259-VP3的構建與鑒定

利用限制性內切酶Sal I和Xhol I雙酶切陽性克隆質粒pMD19T-VP3與腺病毒穿梭載體pCR259，各回收目的片段4 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選出陽性克隆產(chǎn)物接種于Amp/LB，220 r/min，37 ℃過夜培養(yǎng)。將PCR和酶切鑒定均為陽性的質粒（pCR259-VP3）送往上海英駿生物技術公司測序。

1.6 重組腺病毒rAd-VP3的制備

經(jīng)Lipofectamine 2000介導，將測序正確的質粒pCR259-VP3轉染到QBI-HEK293細胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，加入1.5 ml含8%血清的DMEM完全培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)，此后在第1天和第5天更換含3%血清的DMEM完全培養(yǎng)液，經(jīng)過7～10 d培養(yǎng)至出現(xiàn)細胞病變后收獲病毒，即為原代重組腺病毒rAd-VP3，記為f0代。

1.7 rAd-VP3的RT-PCR鑒定

將f0代重組腺病毒rAd-VP3連續(xù)傳代，收集第f0、f2、f6、f10、f12代病毒，應用Trizol試劑提取總RNA，以Oligo（dT）為隨機引物合成cDNA，利用P1、P2引物進行RT-PCR鑒定。

1.8 IFA檢測表達產(chǎn)物 將收集的f0代重組腺病毒rAd-VP3接種于24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的QBI-HEK293細胞，以野生型腺病毒感染QBI-HEK293細胞為對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用預冷的丙酮固定10 min，以自制的兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗體為一抗，以FITC標記的羊抗兔IgG為二抗，在熒光顯微鏡下觀察結果。

1.9 Western blot檢測表達產(chǎn)物

將收集的f0代重組腺病毒rAd-VP3接種于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的QBI-HEK293細胞，以野生型腺病毒感染QBI-HEK293細胞為對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，經(jīng)-20 ℃反復凍融3次后，進行Western blot檢測，以自制的兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗體為一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，DAB顯色后觀察結果。

1.10 重組腺病毒rAd-VP3 TCID50的測定

將QBI-HEK293細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，當細胞生長豐度達70%～80%時，將10倍倍比稀釋的F6代重組腺病毒rAd-VP3（共8個稀釋度：10-10～10-3）接種到96板中，每個稀釋度接種6個孔（100 μl/孔），并設置正常細胞對照組，細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察并記錄病變情況，觀察6 d，通過Reed-Muench法計算重組病毒的TCID50。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增及克隆

從圖1可以看出，經(jīng)PCR擴增的GPV-VP3基因長度為1 605 bp，與預期大小相符，且測序結果正確。構建的質粒pMD19T-VP3經(jīng)Sal I和Xhol I雙酶切后，出現(xiàn)大小約為2 700 bp和1 605 bp的2個片段（圖2），結合測序結果，證明已成功構建pMD19-VP3質粒。

注：M：DL2 000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因PCR產(chǎn)物。

圖1 GPV-VP3基因的PCR擴增

注：M.DL2000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因PCR鑒定結果;2.質粒pMD19T-VP3的Xho l、Sal I雙酶切鑒定結果。

圖2 重組質粒pMD19-VP3的鑒定

2.2 重組腺病毒穿梭質粒pCR259-VP3的鑒定

限制性內切酶Sal I和Xhol I雙酶切陽性克隆質粒pMD19-VP3與腺病毒穿梭載體pCR259，將純化后的目的片段插入到腺病毒穿梭載體pCR259中，經(jīng)PCR擴增出大小為1 605 bp的片段，與預期大小相符。將其質粒酶切后出現(xiàn)大小分別約為4 488 bp和1 605 bp的片段（圖3）。將質粒送往北京英駿生物技術公司測序后證實，已成功構建了重組腺病毒穿梭質粒pCR259-VP3。

注：M1.DL2 000 DNA Marker;M2.DL15 000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因的PCR結果;2.重組質粒pCR259-VP3的Xhol、Sal I雙酶切結果。

圖3 重組質粒pCR259-VP3的鑒定

2.3 重組腺病毒rAd-VP3的制備及毒價測定

利用大量質粒提取試劑盒提取質粒，經(jīng)過Pac I線性化酶切、無水乙醇沉淀后，由Lipofecta mine2000介導轉染至QBI-HEK293細胞中，第8天開始細胞出現(xiàn)皺縮變圓、呈葡萄串狀、逐漸脫落等細胞病變（圖4），收獲病毒，即為f0代重組腺病毒rAd-VP3。收獲的f0代重組腺病毒rAd-VP3盲傳至F6代，經(jīng)Reed-Meunch方法計算rAd-VP3病毒滴度為109.15TCID50/ml。

注：A.重組腺病毒rAd-VP3導致QBI-HEK293細胞出現(xiàn)病變;B.正常QBI-HEK293細胞對照。

圖4 QBI-HEK 293細胞的病變

2.4 rAd-VP3的RT-PCR鑒定

感染rAd-VP3的QBI-HEK293細胞，經(jīng)RT-PCR擴增，f0、f2、f6、f10、f12代均可見1 605 bp特異目的條帶，而空白對照組無特異條帶（圖5），表明rAd-VP3能穩(wěn)定轉錄。

注：M.DL2 000 DNA Marker;F0、 F2、F6、F10、F12：RT-PCR擴增GPV-VP3基因轉錄結果;F：空白對照。

圖5 重組腺病毒rAd-VP3感染的QBI-HEK 293細胞的RT-PCR鑒定

2.5 IFA檢測重組VP3蛋白在QBI-HEK 293細胞中的表達

經(jīng)IFA檢測，在熒光顯微鏡下，接種f0代重組原病毒rAd-VP3的視野下有特異綠色熒光出現(xiàn)，而空白對照組的視野下沒有綠色熒光（圖6），說明f0代重組原病毒rAd-VP3能在QBI-HEK293細胞中表達GPV-VP3蛋白。

2.6 Western blot 分析

經(jīng)Western blot檢測，在f0代重組原病毒rAd-VP3感染的QBI-HEK293細胞裂解物中檢測到分子量為60 Ku的特異性條帶（圖7），而空白對照組未見條帶。結果表明，f0代重組原病毒rAd-VP3能在QBI-HEK293細胞中表達GPV-VP3蛋白。

3 討論

目前，隨著市場對鵝絨需求量的提升，養(yǎng)鵝業(yè)得到了迅

注：A.rAd-VP3在QBI-HEK293細胞中表達GPV-VP3蛋白;B.空白對照。

圖6 IFA檢測重組VP3蛋白在QBI-HEK 293細胞中的表達

注：M.蛋白質標準Marker;1.空白對照;2.rAd-VP3在QBI-HEK293細胞中表達GPV-VP3蛋白。

圖7 Western blot檢測重組VP3蛋白在QBI-HEK293細胞中的表達

猛發(fā)展。但是，隨著集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展以及流通速度加快，使鵝細小病毒病在我國不同地區(qū)出現(xiàn)暴發(fā)和流行，表現(xiàn)為大批雛鵝突然死亡，有的病死率高達100%[4]。由于該病主要發(fā)生于雛鵝群體，病程短，傳播速度快，死亡率高，使鵝細小病毒病成為危害我國養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的最重要傳染病之一，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4-5]。近些年，由于地域的優(yōu)勢，延邊地區(qū)向韓國和日本的鵝絨出口量在穩(wěn)步上升，該地區(qū)對鵝絨的需求量也在上升，這就催生了養(yǎng)鵝業(yè)的快速發(fā)展，但隨著鵝細小病毒病的發(fā)生和流行，嚴重制約了該地區(qū)養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展，應該研制出一種安全、有效的疫苗進行免疫接種，遏制鵝細小病毒病的傳播和蔓延。

從20世紀70年代中期開始，分子生物學技術迅速發(fā)展，使從事疫苗研究的科學家得以從分子水平對病原體的基因進行克隆和表達，用重組DNA技術研制的新型基因工程疫苗除了能保證其同傳統(tǒng)疫苗具有同樣的免疫原性外，最大的優(yōu)越性是安全性高和經(jīng)濟效益好，避免了傳統(tǒng)疫苗毒力返強、滅活不徹底等潛在危險，同時也具有易于區(qū)分免疫和自然感染的優(yōu)點。在鵝細小病毒病結構蛋白（VP1、VP2、VP3）中，衣殼蛋白VP3是病毒的主要結構蛋白，約占總衣殼蛋白含量的80%，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激機體產(chǎn)生保護性中和抗體的重要抗原蛋白，所以VP3基因是研制基因工程疫苗的首選基因[6]。車茜等[7]通過基因槍轟擊，將VP3基因疫苗（pcDNAGPV-VP3）接種免疫雛鵝，所誘導細胞免疫和體液免疫的能力明顯強于弱毒疫苗。許洪潔等[8]將真核表達質粒（pVAXI-GPV-VP3）免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)真核表達載體疫苗可誘導小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫，但細胞免疫水平不顯著。盧菲等[9]對GPV-VP3基因疫苗與弱毒疫苗進行了比較研究，對于GPV-VP3基因疫苗的免疫效力有不同的評價結果。高旭等[10]構建了包含GPV-VP3基因的VP2基因工程亞單位疫苗，免疫實驗動物后可產(chǎn)生較高的抗體水平，短期免疫效果明顯，但不能持久產(chǎn)生抗體，不能誘導持久的體液免疫和細胞免疫水平，這是不能回避的關鍵問題。活載體疫苗解決了此難題，活病毒載體不僅失去了致病性，而且還能在免疫機體內持續(xù)表達外源保護性抗原基因，兼有滅活疫苗和活疫苗的優(yōu)點。在諸多的活病毒載體中，經(jīng)過改造后的腺病毒安全性高、毒性低、宿主范圍廣，能同時誘導機體產(chǎn)生B細胞免疫和T細胞免疫反應，已成為目前最有應用前景的疫苗載體之一，被廣泛應用于各種預防性或治療性疫苗的研發(fā)，如HIV、流感、乙肝、狂犬病等疾病的腺病毒載體疫苗，并取得了可喜的效果[3]。但關于腺病毒載體用于鵝細小病毒方面的研究尚未見報道，所以這方面的研究與開發(fā)將有很大的空間和前景。

該研究以前期分離的YBLJ株GPV強毒[11]為毒種，克隆能產(chǎn)生中和抗體的VP3基因，所構建的腺病毒載體疫苗具有顯著的地域性和針對性，對預防延邊地區(qū)鵝細小病毒病發(fā)生和凈化鵝細小病毒將具有重要意義。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，雖然GPV-VP3基因較長（1 605 bp），但在Lipofecta mine2000的介導下線性化的重組腺病毒穿梭質粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293細胞中瞬時表達GPV-VP3蛋白，通過IFA和Western blot檢測，蛋白表達量較高，再次證實GPV-VP3腺病毒載體疫苗研制的可行性，隨著下一步體內免疫試驗的開展，將驗證該活載體疫苗的免疫效力和免疫機制，為GPV新型疫苗研發(fā)以及探討腺病毒載體應用于鵝細小病毒病預防的前景奠定基礎，進一步促進養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。

參考文獻

[1]方定一，王永坤，鄭玉美，等.小鵝瘟病原體及其特異性防治的研究[J].中國農業(yè)科學，1981（1）：1-8.

[2] 張穎，魯承，趙文婧，等. 鵝細小病毒YBLJ株VP3基因的真核表達[J].動物醫(yī)學進展，2012，33（12）：23-25.

[3] 楊勇，周東明.腺病毒載體疫苗的臨床研究進展[J].生命的化學，2014，34（1）：46-51.

[4] 馬磊，董浩，蔣運博，等.鵝細小病毒研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（6）：165-168.

[5] YIN X，ZANG S，GAO Y，et al.Characterization of monoclonal antibodies against waterfowl parvoviruses VP3 protein [J].Virol J，2012，9（1）：288-294.

[6] YU T F，MA B，GAO M C，et al.Localization of linear B-cell epitopes on goose parvovirus structural protein [J].Vet Immunol Immunopathol，2012，15（1/2）：522-526.

[7] 車茜.小鵝瘟病毒VP3基因疫苗誘導雛鵝細胞免疫和體液免疫的研究[D].雅安：四川農業(yè)大學，2007.

[8] 許洪潔，張鑫，夏銘琦，等.小鵝瘟病毒VP3基因真核表達質粒在小鼠中的免疫效果[J].中國獸藥雜志，2008，42（1）：5-8.

[9] 盧菲，程安春，汪銘書，等.鵝細小病毒VP3基因疫苗與弱毒疫苗誘導小鼠免疫應答的比較[J].中國獸醫(yī)科學，2008，38（7）：576-581.

[10] 高旭，張穎，魯承，等.鵝細小病毒VP2基因工程亞單位疫苗的免疫試驗[J].吉林農業(yè)，2012，263（1）：171.

[11] 高旭，張穎，魯承.鵝細小病毒強毒YBLJ株的分離鑒定與VP3基因的進化分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2011，33（12）：924-926.