李建欣+代西梅+李林玉+黃群策

摘要：為進(jìn)一步了解水稻雄性不育現(xiàn)象，研究了核質(zhì)互作型雄性不育水稻不育系451A及保持系451B分蘗期葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）含量的動(dòng)態(tài)變化情況。結(jié)果表明，不育系水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的分蘗期SOD、POD、CAT活性以及MDA含量表現(xiàn)異常，不育系水稻SOD活性高于保持系，不育系水稻CAT活性低于保持系，導(dǎo)致不育系水稻MDA含量較高，這可能引起了水稻能量、物質(zhì)代謝異常，膜脂過(guò)氧化逐漸積累，從而造成了花粉敗育。

關(guān)鍵詞：水稻；雄性不育系；分蘗期；超氧化物歧化酶；丙二醛

中圖分類號(hào)：S511.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0081-02

雄性不育是雄性器官退化、發(fā)育不良或花粉敗育，不能行使生殖能力而雌蕊發(fā)育正常的現(xiàn)象。雄性不育起源于遺傳性遠(yuǎn)緣異質(zhì)的植物雜交，后代產(chǎn)生了生理、代謝紊亂，致使雄性生殖細(xì)胞敗育。植物雄性不育有2種類型：一種為生理上的雄性不育，是由逆境脅迫及各種理化因素造成的，不育性不能傳給后代，育種上不能連續(xù)利用；另一種為遺傳上的雄性不育，是受雄性不育基因控制，這種基因一般屬隱性，有重要的利用價(jià)值^[1]。核質(zhì)互作型雄性不育又稱細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS），屬于遺傳不育。植物育性的表達(dá)是由基因控制的生理過(guò)程、生化反應(yīng)、形態(tài)構(gòu)建的最終結(jié)果，包括一系列物質(zhì)代謝、能量代謝，涉及各種復(fù)雜的生理生化反應(yīng)?；蚩刂泼傅鞍椎暮铣?，酶又調(diào)控代謝反應(yīng)，多個(gè)代謝反應(yīng)的綜合集中表現(xiàn)便是性狀。因此育性的變化也是酶活性變化引起的結(jié)果之一^[2]。植物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生有氧自由基，遇逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)大量增生自由基，致使膜脂過(guò)氧化嚴(yán)重，造成膜結(jié)構(gòu)受損，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被改變，最終對(duì)生物體產(chǎn)生傷害。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）是植物抗氧化酶促防御系統(tǒng)中的3個(gè)主要酶類。SOD對(duì)活性氧的清除反應(yīng)過(guò)程為：2O-2+2H+→H2O2+O2，POD、CAT進(jìn)一步催化H2O2分解成H2O從而徹底解毒，使植物體內(nèi)活性氧保持在較低水平，這3種酶協(xié)同作用，可減輕自由基對(duì)生物體造成的毒害，提高機(jī)體抗逆能力。丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，它的含量高低可反映細(xì)胞膜受損害的程度。前人對(duì)水稻生殖生長(zhǎng)階段的生理生化反應(yīng)進(jìn)行了研究，但是關(guān)于水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的動(dòng)態(tài)研究還比較少。本研究以核質(zhì)互作型雄性不育水稻為材料，調(diào)查了分蘗期水稻葉片中SOD、POD、CAT、MDA含量變化，以探討水稻不育系不育的生理機(jī)制，旨在為進(jìn)一步豐富水稻雄性不育理論提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

核質(zhì)互作型雄性不育水稻451A及保持系451B均由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院秋糧研究所提供。供試水稻種植于河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)，采用常規(guī)管理。水稻分蘗初期到后期每隔5 d取1次材料。取每株主莖上面第1張全展葉，每次取3張葉中部，放冰上帶回實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2 粗酶液提取和酶活性測(cè)定

稱取葉片樣品0.5 g置于預(yù)冷的研缽中，加入1 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH值為7.8），冰浴研磨成漿，加緩沖液使終體積為5 mL，于11 000×g、4 ℃下離心15 min，上清液即為SOD、POD、CAT粗提液，3次重復(fù)^[3-4]。采用NBT（氮藍(lán)四唑）光還原法測(cè)定葉片SOD活性。反應(yīng)液為3 mL NBT、1 mL酶液，對(duì)照液為3 mL NBT、1 mL磷酸緩沖液（pH值為7.8），25～30 ℃、4 000 lx于日光下反應(yīng)20 min，調(diào)零液遮光，560 nm 下測(cè)定吸光度值。SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)酶活性單位來(lái)表示。采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性。反應(yīng)液為2.7 mL磷酸緩沖液、100 μL愈創(chuàng)木酚、100 μL H2O2、100 μL酶液，470 nm下測(cè)定吸光度值，每隔 1 min 讀數(shù)1次，共測(cè)4 min，磷酸緩沖液調(diào)零。采用紫外吸收法測(cè)定CAT活性。反應(yīng)液為2.8 mL磷酸緩沖液（pH值為7.8）、100 μL H2O2、100 μL酶液，240 nm下測(cè)定吸光度值，每隔1 min讀數(shù)1次，共測(cè)4 min，磷酸緩沖液調(diào)零。MDA提取與活性測(cè)定：稱取葉片樣品1 g置于預(yù)冷的研缽中，加入2 mL 10% TCA、少量石英砂，研磨至勻漿，再加8 mL TCA進(jìn)一步研磨勻漿，4 000 r/min離心10 min，上清液為樣品提取液。采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。吸取離心的上清液 2 mL，加入2 mL 0.6% TBA溶液，混勻于沸水浴上反應(yīng) 15 min，迅速冷卻后再離心。取上清液測(cè)定532、450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，蒸餾水調(diào)零。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDA含量的變化

由表1可見(jiàn)，分蘗期前期不育系水稻葉片中MDA含量極顯著高于保持系，分蘗期后期不育系仍然顯著高于保持系，但是沒(méi)有分蘗前期顯著?？傮w來(lái)說(shuō)，不育系由分蘗前期到分蘗后期有下降的趨勢(shì)，保持系變化沒(méi)有不育系大。

2.2 SOD活性的變化

由表1可見(jiàn)，分蘗期前3個(gè)時(shí)間點(diǎn)不育系及保持系水稻葉片SOD活性均下降，分蘗期后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)不育系及保持系水稻葉片SOD活性均上升。每個(gè)時(shí)期不育系水稻葉片SOD活性均高于保持系。

2.3 CAT活性的變化

由表1可見(jiàn)，從分蘗期開(kāi)始到最后，不育系水稻葉片CAT活性有波動(dòng)但是整體變化不大，保持系水稻葉片CAT活性下降趨勢(shì)明顯，總體而言，不育系水稻分蘗期不育系葉片CAT活性略低于保持系。

2.4 POD活性的變化

由表1可見(jiàn)，分蘗期前2個(gè)時(shí)間點(diǎn)不育系及保持系水稻葉片POD活性均下降，分蘗期后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)不育系及保持系后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)水稻葉片POD活性均上升。從總體趨勢(shì)來(lái)看，不育系水稻葉片POD活性高于保持系。

3 結(jié)論與討論

酶是生物體內(nèi)的一種特殊的催化刑，由活的生物體合成。酶的活性取決于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，任何破壞酶蛋白的因素都能導(dǎo)致酶活性喪失。酶有調(diào)控代謝反應(yīng)的功能，正是由于酶、代謝、生理功能之間的相互關(guān)系，使得酶活性變化與育性變化有著密切的關(guān)系。植物體內(nèi)酶的種類、存在量的多少、酶的方向都會(huì)直接影響植株生長(zhǎng)發(fā)育、可育與不育等特性。

植物生長(zhǎng)過(guò)程中，不斷吸收H2O及CO2進(jìn)行光合作用，生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)并放出O2，氧在自身還原過(guò)程中形成陰離子自由基、羥自由基的活性氧。在光合作用中，植物不可避免地要經(jīng)受強(qiáng)光、高溫環(huán)境，光激發(fā)產(chǎn)生的多余能量在光合器中形成單線態(tài)氧[5～8]。在光呼吸等代謝過(guò)程中，也會(huì)有許多H2O2產(chǎn)生，這些H2O2可以通過(guò)Habcr-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的OH·自由基。OH·可引發(fā)脂質(zhì)尤其是膜不飽和脂的過(guò)氧化，損害生物膜結(jié)構(gòu)，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，損傷DNA等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能等。在生物進(jìn)化過(guò)程中，生物也形成了抵抗活性氧傷害的防御系統(tǒng)。SOD是植物體內(nèi)解除O-2毒害作用的關(guān)鍵性酶。CAT、POD則將H2O2通過(guò)Habcr-Weiss反應(yīng)進(jìn)一步分解而徹底解毒。

以往學(xué)者們對(duì)于不育水稻抗氧化酶促防御系統(tǒng)幾種關(guān)鍵指標(biāo)的研究結(jié)果不盡相同。陳賢豐等以PTGMS不育系農(nóng)墾58S和w6154S為材料研究發(fā)現(xiàn)，單核早期、單核晚期、二核及三核期的不育花藥2種酶在每小穗花藥中的總活性普遍低于其可育花藥^[9]。張明永等比較了CMS水稻不育系珍汕97A及其同核異質(zhì)保持系珍汕97B，結(jié)果表明，與可育三核期花藥相比，不育三核期2種酶活性較低^[10]。梅啟明等研究發(fā)現(xiàn)，從穗發(fā)育雌雄蕊原基分化期到三核期，不育系農(nóng)墾58S幼穗或花藥中SOD活性明顯比其可育狀態(tài)下的高^[11]。鄒國(guó)林等研究發(fā)現(xiàn)，穗分化第2次枝梗原基分化期至花粉母細(xì)胞形成期，農(nóng)墾58S葉片SOD比活力高于農(nóng)墾58，同一品種，長(zhǎng)日SOD活性高于短日，農(nóng)墾58S 葉片CAT比活力變化較顯著，但無(wú)規(guī)律^[12]。

本研究表明，分蘗期不育系水稻SOD活性比保持系高，推測(cè)不育系受到了更強(qiáng)的H2O2傷害，在此時(shí)期不育系水稻CAT活性反而遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于保持系，由此可推測(cè)不育系有更多的OH·自由基沒(méi)有被清除，導(dǎo)致MDA含量增大。分蘗期不育系水稻SOD活性始終高于保持系也從側(cè)面證明了不育系受到比保持系更多的H2O2傷害。不育系水稻CAT的酶活性比保持系少，由此可推測(cè)在此過(guò)程中不育系受OH·自由基的損害作用大，證明不育系一直有較多的脂質(zhì)尤其是膜不飽和脂過(guò)氧化。前人發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻的花粉敗育大多數(shù)發(fā)生在減數(shù)分裂期到二核期，分蘗期要遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于花粉敗育時(shí)期。根據(jù)MDA、SOD、POD、CAT一系列變化結(jié)果說(shuō)明了水稻核質(zhì)互作型雄性不育花粉敗育是一個(gè)逐漸積累的、由量變到質(zhì)變的過(guò)程，而不是一個(gè)“躍遷”的過(guò)程，推測(cè)可能從分蘗期甚至更早的發(fā)育時(shí)期花藥的酶促系統(tǒng)已出現(xiàn)了異常，最后發(fā)育至花粉敗育時(shí)期。本試驗(yàn)中，不育系水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的分蘗期SOD、POD、CAT活性以及MDA含量表現(xiàn)異常，不育系水稻SOD活性高于保持系，不育系水稻CAT活性低于保持系，導(dǎo)致不育系水稻MDA含量較高，這可能引起了水稻能量、物質(zhì)代謝異常，膜脂過(guò)氧化逐漸積累，從而造成了花粉敗育。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱英國(guó)，利容千，汪明全. 水稻雄性不育生物學(xué)[M]. 武漢：武漢大學(xué)出版社，2000.

[2]梅啟明，朱英國(guó)，張紅軍. 湖北光敏核不育水稻中酶的反應(yīng)特征研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，9（4）：469-471.

[3]高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[4]杜士云，王德正，吳 爽，等. 三類雄性不育水稻花藥和葉片中抗氧化酶活性變化[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2012，48（12）：1179-1186.

[5]舒孝順，陳良碧. 溫敏核不育水稻育性敏感期過(guò)氧化物酶活性（簡(jiǎn)報(bào)）[J]. 植物生理學(xué)通訊，1999，35（6）：466-468.

[6]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[7]王志強(qiáng)，劉文芳，肖翊華. HPGMR農(nóng)墾58S葉片中過(guò)氧化物酶活性變化的比較研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，9（4）：466-468.

[8]Wan C X，Li S Q，Wen L，et al. Damage of oxidative stress on mitochondria during microspores development in Honglian CMS line of rice[J]. Plant Cell Reports，2007，26（3）：373-382.

[9]陳賢豐，梁承鄴. 水稻不育花藥中H2O2的積累與膜脂過(guò)氧化的加劇[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，1991，17（1）：44-48.

[10]張明永，梁承鄴，段 俊，等. CMS水稻不同器官的膜脂過(guò)氧化水平[J]. 作物學(xué)報(bào)，1997，23（5）：603-606.

[11]梅啟明，朱英國(guó). 不同光誘導(dǎo)條件下HPGMR中SOD的比較研究[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，1990，4（1）：43-45.

[12]鄒國(guó)林，劉俊松，陳克成，等. 光敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)變敏感期超氧化物歧化酶與丙二醛的變化[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1991（4）：95-100.