趙樹(shù)彌+朱靈+朱燦燦等

摘要集成核酸提取的實(shí)時(shí)熒光PCR微全分析系統(tǒng)將核酸提取、PCR擴(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)進(jìn)行整合，在同一塊微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了核酸分析過(guò)程的全自動(dòng)和全封閉，具有試劑用量少、分析速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用微機(jī)械加工技術(shù)制作集成核酸提取微流控芯片的陽(yáng)極模，使用組合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片，與玻璃基底通過(guò)等離子體鍵合封裝成集成核酸提取芯片。構(gòu)建了由微流體速度可調(diào)節(jié)（0～10 mL/min）的驅(qū)動(dòng)控制裝置、溫控精度可達(dá)0.1 ℃的TEC溫控平臺(tái)、CCD檢測(cè)功能模塊等組成的微全分析系統(tǒng)。以人類(lèi)血液裂解液為樣品，采用硅膠膜進(jìn)行芯片上核酸提取。系統(tǒng)根據(jù)設(shè)置好的時(shí)序自動(dòng)執(zhí)行，以2 mL/min的流體驅(qū)動(dòng)速度完成20 μL裂解液上樣、清洗； 以1 mL/min的流體驅(qū)動(dòng)速度完成DNA洗脫，抽取PCR試劑與之混合注入到反應(yīng)腔。提取的基因組DNA以鏈上內(nèi)參基因GAPDH為檢測(cè)對(duì)象，并以傳統(tǒng)手工提取為對(duì)照，在該系統(tǒng)平臺(tái)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析實(shí)驗(yàn)。片上PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線明顯，Ct值分別為25.3和26.9。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析得到的熔解溫度一致，均為89.9 ℃。結(jié)果表明，此系統(tǒng)能夠自動(dòng)化、全封閉的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR擴(kuò)增與實(shí)時(shí)定量分析。關(guān)鍵詞核酸提取； 微全分析系統(tǒng)； 實(shí)時(shí)熒光PCR； 微流控芯片

核酸作為基本的遺傳物質(zhì)，攜帶著各種信息，對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能的認(rèn)識(shí)，有利于研究物種的遺傳、進(jìn)化以及疾病診斷等[1]。微流控芯片在核酸分析方面有著廣泛和極其重要的應(yīng)用，如基因突變檢測(cè)[2]、病原體基因鑒定[3，4]、SNP（Single nucleotide polymorphism）分析[5]等。傳統(tǒng)的PCR（Polymerase chain reaction）技術(shù)雖然能實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增檢測(cè)，但其檢測(cè)結(jié)果受人為因素的影響較大，需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，而熒光定量PCR技術(shù)和微流控技術(shù)的相結(jié)合，能實(shí)現(xiàn)核酸操作過(guò)程的自動(dòng)化、全封閉，簡(jiǎn)化了人工的操作過(guò)程，避免了過(guò)程污染，提高了核酸檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性[6～8]。集成核酸提取功能的實(shí)時(shí)熒光PCR微全分析系統(tǒng)將樣品前處理、PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)功能模塊集成，能直接給出分析結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)“樣品進(jìn)結(jié)果出”這一目標(biāo)。因此，微全分析系統(tǒng)現(xiàn)已成為分析儀器和分析科學(xué)發(fā)展的重要方向和前沿[9～11]。

集成化的微流控芯片通常將微流體控制與分析單元集成在芯片上，如微泵、微閥、微加熱器、微混合器、微流量控制器以及微檢測(cè)器等，使體積微型化和功能集成化，在較短時(shí)間內(nèi)精確完成從樣品制備到結(jié)果顯示的全部過(guò)程[12～14]。盡管大規(guī)模集成的微全分析系統(tǒng)還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，但隨著微流控芯片的運(yùn)用與發(fā)展[15～17]，針對(duì)特定功能的微流控芯片及系統(tǒng)發(fā)展迅速[18，19]，如靜態(tài)腔式微流控PCR系統(tǒng)[20]、具有樣品前處理功能的核酸提取系統(tǒng)[21，22]、集成化的溫控系統(tǒng)[23]、微型化的檢測(cè)系統(tǒng)[24]。目前，由于各功能模塊的研究突破，促進(jìn)了集成化的發(fā)展，但形成一個(gè)完整的集成化系統(tǒng)還存在著很大的技術(shù)難度[25，19]。

本實(shí)驗(yàn)基于固相萃取法[26]，采用硅膠膜提取核酸[27]，設(shè)計(jì)并制作了集成核酸提取的微流控芯片。使用自主研發(fā)的實(shí)時(shí)熒光PCR微全分析系統(tǒng)，成功提取了人全血中的基因組DNA，對(duì)基因組上穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH）進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。開(kāi)展了傳統(tǒng)手工提取核酸的對(duì)照試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)比，驗(yàn)證了集成核酸提取的實(shí)時(shí)熒光PCR微全分析系統(tǒng)的可行性，實(shí)現(xiàn)了在同一塊微流控芯片上完成核酸的提取與分析過(guò)程。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1芯片設(shè)計(jì)與制作

通過(guò)微機(jī)械加工技術(shù)[28]在一個(gè)很小體積的金屬塊上加工各種微小型腔體，然后把它們作為一個(gè)鑲塊嵌入模板并進(jìn)行整體組裝，組裝成的模具示意圖如圖1A所示，模具尺寸為40 mm×50 mm×10 mm，制作芯片的實(shí)物如圖1B所示。C1是Buffer Aw1試劑腔，C2是Buffer Aw2試劑腔，C4是AE試劑腔，C5是PCR反應(yīng)試劑腔，C1～C3的體積均為110 μL，C4～C6的體積均為50 μL；E是50 μL的提取腔；W是224 μL的廢液腔；M是50 μL的混合腔；扁平形的PCR反應(yīng)腔體積為20 μL。

圖1模具示意圖（A）和集成核酸提取芯片（B）

Fig.1Schematic diagram of chip mold （A） and integrated DNA extraction chip （B）核酸提取芯片的制作采用模具組合法[29，30]生成，這不僅便于微小型腔的微細(xì)加工和鑲塊的更換，而且能夠提高模具整體的使用壽命。嵌入體在PDMS膠水（Sylgard 184， DowCorning）中構(gòu)成3D結(jié)構(gòu)，這種3D的通道可以像立交橋分層相互獨(dú)立貫穿整個(gè)空間，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的3D通道。固化后的PDMS 表面具有一定的粘附力， 可借助分子間的引力自然與玻璃基板進(jìn)行粘合， 但這種粘合強(qiáng)度有限， 容易發(fā)生漏液。本研究采用氧等離子體鍵合的方法[31]處理PDMS 芯片與玻璃基片35 s，改善了PDMS和玻璃表面活性，然后貼合放置在90 ℃的恒溫箱烘烤30 min，使芯片成為永久性粘合。分 析 化 學(xué)第42卷第10期趙樹(shù)彌等： 集成核酸提取的實(shí)時(shí)熒光PCR微全分析系統(tǒng)

2.2芯片的驅(qū)動(dòng)控制

微機(jī)械加工技術(shù)在芯片上制備出精細(xì)和復(fù)雜的幾何通道結(jié)構(gòu)，可利用通道自身特性和特征進(jìn)行微流體的流動(dòng)控制[32]。由于微通道中表面積與體積之比非常大，表面效應(yīng)極大影響流體流動(dòng)，給微流體驅(qū)動(dòng)和控制帶來(lái)了困難。芯片上的操作過(guò)程包括細(xì)胞裂解液加載，硅膠膜上DNA吸附、清洗、洗脫，反應(yīng)試劑的混合以及PCR反應(yīng)。在對(duì)微流體特性進(jìn)行深入分析的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了一套相應(yīng)的驅(qū)動(dòng)控制裝置。硬件設(shè)備主要包括FPGA核心電路板、陣列電磁閥、氣體質(zhì)量流量控制器、微型真空泵。陣列電磁閥上配置壓力傳感器和減壓閥；微真空泵的最大真空度為60 kPa， 最大流速為15 L/min；氣體質(zhì)量流量控制器的對(duì)流體的流速控制范圍在0～10 mL/min。FPGA電路控制陣列電磁閥為芯片上流體的操控提供時(shí)序控制， 外置氣動(dòng)泵和流量控制器對(duì)微流體進(jìn)行可調(diào)節(jié)的驅(qū)動(dòng)和控制。

2.3實(shí)時(shí)熒光PCR分析裝置

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析裝置集成了三大功能模塊： 工控機(jī)、CCD熒光檢測(cè)模塊和半導(dǎo)體溫控模塊，如圖2A所示。工控機(jī)控制系統(tǒng)是分析平臺(tái)的操控中心，不僅協(xié)調(diào)各模塊的操作控制，還對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。CCD熒光檢測(cè)模塊的總體性能將影響整個(gè)分析系統(tǒng)的檢出限、檢測(cè)速度、適用范圍等指標(biāo)[24]， 其結(jié)構(gòu)如圖2B所示，主要由微流控芯片、LED光源、CCD探測(cè)器三部分組成。CCD探測(cè)器性能以熒光素鈉模擬測(cè)試達(dá)到了5×1010mol/L，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的探測(cè)。溫控是PCR正常進(jìn)行的關(guān)鍵，溫控的準(zhǔn)確性決定了PCR擴(kuò)增的成敗。本實(shí)驗(yàn)采用半導(dǎo)體制冷器（TEC）來(lái)控制微流控PCR芯片的溫度，通過(guò)PID算法[33]來(lái)實(shí)現(xiàn)溫度循環(huán)的快速準(zhǔn)確控制，溫控平臺(tái)如圖2C所示。PCR溫控系統(tǒng)升溫速率為7.2 ℃/s，降溫速率為5 ℃/s，溫控精度達(dá)到了0.1 ℃，完全能夠滿足PCR溫度控制的需求。本實(shí)驗(yàn)制作的PDMS基片厚度為7.5 mm，PDMS材料本身導(dǎo)熱性差，使得腔內(nèi)反應(yīng)溫度不受外界影響。腔內(nèi)的溫度變化主要通過(guò)玻璃與TEC熱交換實(shí)現(xiàn)。反應(yīng)腔的體積為20 μL，屬于大體系下的PCR反應(yīng)[20]。PCR實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)溫度設(shè)置均低于水的沸點(diǎn)，腔內(nèi)水分快速蒸發(fā)滲透到外表面難以發(fā)生。

2.5實(shí)驗(yàn)方法

血液按照裂解試劑盒（QIAamp DNA Micro Kit）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行裂解，然后將裂解過(guò)的血溶液（20 μL）加載到微流控芯片上，啟動(dòng)微全分析系統(tǒng)。手工提取核酸使用離心機(jī)按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)提取方法進(jìn)行[27]。提取完成之后取約為2 μL DNA原液與20 μL PCR反應(yīng)試劑混合，注入到芯片的PCR反應(yīng)腔進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。無(wú)論是芯片上自動(dòng)提取的核酸，還是手工提取的核酸，擴(kuò)增檢測(cè)均使用同一條件。根據(jù)所選的基因片段設(shè)置反應(yīng)所需要的條件：預(yù)變性階段95 ℃保持160 s后直接進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段；95 ℃保持15 s，降溫至60 ℃保持40 s，然后在72 ℃保持60 s，執(zhí)行40次循環(huán)；設(shè)置熔解的升溫步長(zhǎng)為1 ℃/s， 每個(gè)步長(zhǎng)保持時(shí)間為5 s。儀器根據(jù)設(shè)置好的參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，給出分析結(jié)果。

3結(jié)果與討論

3.1微流體驅(qū)動(dòng)與控制分析

集成核酸提取的PCR芯片流體通道為200～500 μm之間，提取過(guò)程中微流體在不同尺度的微通道內(nèi)多次交替，要求流體的驅(qū)動(dòng)力不同，因此，微流體的驅(qū)動(dòng)和控制尤其顯得困難。這種流動(dòng)特性的變化使得宏觀流體驅(qū)動(dòng)與控制技術(shù)在微流體中的簡(jiǎn)單移植往往不成功或者效果不好。本研究根據(jù)集成核酸提取的微流控芯片的驅(qū)動(dòng)和控制要求，對(duì)于裂解液的廢液抽取，Buffer Aw1、Buffer Aw2的驅(qū)動(dòng)均采用2 mL/min的速度控制。 對(duì)于洗脫液AE、PCR反應(yīng)試劑驅(qū)動(dòng)，PCR反應(yīng)腔溶液的注入均采用1 mL/min的速度控制。氣體流量控制器根據(jù)不同時(shí)段、不同量的驅(qū)動(dòng)，采用不同的驅(qū)動(dòng)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)可變的控制，滿足了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的微流體運(yùn)動(dòng)的控制和驅(qū)動(dòng)。

3.2核酸提取過(guò)程分析

芯片上核酸提取過(guò)程的原理如圖3所示。在實(shí)物圖中，C0是提取腔里的一部分，提取腔E底層為微通道連接，中間層是硅膠膜，上層是血液加載腔；V1～V8是微閥連接微泵的通道，+號(hào)表示往管道施加正壓；號(hào)是表示施加負(fù)壓，氣路處于抽取空氣狀態(tài)。芯片上的操作過(guò)程包括FPGA控制系統(tǒng)首先啟動(dòng)1號(hào)和5號(hào)電磁閥，抽取裂解液中的廢液至廢液腔；其次啟動(dòng)2號(hào)電磁閥，氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)50 μL Buffer Aw1到吸附柱中，洗滌DNA中雜質(zhì)；30 s后啟動(dòng)5號(hào)電磁閥抽取廢液；廢液排空后，啟動(dòng)3號(hào)電磁閥，驅(qū)動(dòng)50 μL Buffer Aw2到吸附柱中，再次洗滌DNA中雜質(zhì)；30 s后再次啟動(dòng)5號(hào)電磁閥抽取廢液；待洗滌液除盡后，繼續(xù)抽吸吸附柱，直到吸附膜干燥后關(guān)閉；啟動(dòng)4號(hào)電磁閥，加入10 μL AE到吸附柱中，洗脫DNA，打開(kāi)7號(hào)電磁閥抽約2 μL至混合腔；啟動(dòng)6號(hào)電磁閥，推入PCR反應(yīng)試劑20 μL到混合腔；最后啟動(dòng)8號(hào)電磁閥，抽取混合腔溶液至PCR反應(yīng)腔，對(duì)PCR反應(yīng)腔兩端進(jìn)行密封，即可開(kāi)始PCR擴(kuò)增與熔解檢測(cè)分析。

Fig.3Schematic diagrams of nucleic acid extraction提取腔中的硅膠膜具有在高鹽低pH條件下能吸附DNA，低鹽高pH條件下釋放DNA的特性。在提取過(guò)程中通過(guò)Buffer Aw1的沖洗作用去除硅膠膜上吸附的蛋白、脂質(zhì)等雜質(zhì)，以獲得高質(zhì)量基因組DNA；通過(guò)Buffer Aw2的沖洗作用去除殘留乙醇，避免影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（PCR或酶切）；通過(guò)洗脫液TE的作用將膜上結(jié)合的DNA洗脫至溶液中，同時(shí)利于基因組DNA 充分溶解。混合腔利用重力溶合PCR試劑和DNA溶液，經(jīng)過(guò)S通道又進(jìn)一步混合[34]。整個(gè)DNA的提取到PCR反應(yīng)，過(guò)程操作快速、簡(jiǎn)便。

3.3核酸的擴(kuò)增檢測(cè)分析

對(duì)于提取的DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，首先加熱使DNA雙鏈在95℃解鏈變?yōu)閮蓷l單鏈，然后降溫至延伸階段，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，DNA單鏈合成雙鏈，數(shù)量成倍增加，實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)擴(kuò)增。SYBR Green熒光染料能與DNA雙鏈結(jié)合，通過(guò)中心波長(zhǎng)約為497 nm的LED激發(fā)光激發(fā)能夠發(fā)出波長(zhǎng)約為520 nm的熒光[35]。在延伸期，利用CCD檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，就能實(shí)現(xiàn)DNA序列擴(kuò)增量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。因此，在PCR擴(kuò)增體系內(nèi)，熒光信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。本研究針對(duì)提取的DNA鏈上的GAPDH基因，自行設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與熔解曲線分析。通過(guò)分析GAPDH基因的檢測(cè)結(jié)果，可以對(duì)DNA提取效率以及提取質(zhì)量加以判別分析。

本研究對(duì)兩種提取方法進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。在圖4中曲線1、2為手工提取核酸的擴(kuò)增曲線，曲線3、4為芯片上自動(dòng)提取核酸的擴(kuò)增曲線。從圖4A可見(jiàn)，手工提取與芯片法提取的DNA鏈上的GAPDH基因在PCR反應(yīng)后均獲得了明顯的擴(kuò)增，手工提取法的Ct值（反應(yīng)腔內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）分別是22.5和23.0， 芯片法的Ct值分別為25.3和26.9，結(jié)果表明均實(shí)現(xiàn)了基因組DNA的提取與GAPDH基因的擴(kuò)增檢測(cè)。從熔解曲線圖4B可見(jiàn)，均有統(tǒng)一的熔解溫度值89.9℃，表明了芯片法提取結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于手工提取與芯片自動(dòng)提取使用的裂解液量與洗脫液量比例不同，提取的DNA濃度有差異，所以擴(kuò)增曲線不完全重合。但是從熔解曲線可以看出，單一的熔解峰，相一致的熔解溫度值表明了擴(kuò)增產(chǎn)物是來(lái)自基因組DNA的同一個(gè)基因片段，而且提取的基因組DNA純度高、質(zhì)量好。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功研制了集成核酸提取的PCR芯片以及芯片的驅(qū)動(dòng)控制、檢測(cè)、分析系統(tǒng)，并成功地從人體全血的裂解液中提取了基因組DNA，并進(jìn)行了GAPDH基因的擴(kuò)增與檢測(cè)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比驗(yàn)證了系統(tǒng)的可行性與結(jié)果的正確性。芯片上核酸提取使用的試劑量幾乎是傳統(tǒng)法的1/10，而且全自動(dòng)化、全封閉的操作，大大改善了傳統(tǒng)操作技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、試劑消耗量大、操作步驟繁瑣、操作過(guò)程易受污染等缺點(diǎn)。本研究使得集成核酸提取的實(shí)時(shí)熒光PCR微全分析系統(tǒng)本身具有的快速、高靈敏度、低消耗、易于集成化、便攜化的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)更好、更充分的發(fā)揮出來(lái)，提高了微流控芯片的自動(dòng)化操作水平。

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