梁達(dá)清，蘇肯明，張菊梅，郭偉鵬

（廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地），廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，廣東 廣州 510070）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香菇中23種有機(jī)磷農(nóng)藥

梁達(dá)清，蘇肯明，張菊梅，郭偉鵬

（廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地），廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，廣東 廣州 510070）

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香菇中23種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。樣品通過乙腈提取、鹽析分配，得到的乙腈提取液采用C18和N-丙基乙二胺粉末分散固相萃取凈化，經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，采用電噴霧正離子方式及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。方法的定量限達(dá)到0.01mg/kg；回收率為70.2%～105.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～13.0%。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，可滿足香菇中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；有機(jī)磷農(nóng)藥；殘留；香菇

香菇含有大量多糖、嘌呤、核酸及含硫香味成分等，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，且具有降低血壓、抗病毒、抗癌等功效[1-2]，是一種重要的食用菌。在栽培過程中，若使用有農(nóng)藥污染的基質(zhì)載體或因病蟲害嚴(yán)重而大量使用農(nóng)藥，容易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)。有機(jī)磷農(nóng)藥是一種高效、廣譜的殺蟲劑，多數(shù)屬劇毒和高毒類，對(duì)人體有極大的危害。各國都加強(qiáng)了對(duì)農(nóng)藥殘留的監(jiān)控，美國、歐盟、日本等均制定了日益嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，如日本《食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度》中對(duì)多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥的限量為0.01mg/kg[3]。因此簡(jiǎn)便快速的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)技術(shù)是今后農(nóng)殘檢測(cè)的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)。

目前有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[4-13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14-20]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-25]，而用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香菇中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法未見報(bào)道。用氣相色譜測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥時(shí)，襯管中的玻璃纖維對(duì)乙酰甲胺磷和氧化樂果吸附嚴(yán)重，易導(dǎo)致測(cè)試靈敏度降低，當(dāng)除掉襯管中的玻璃纖維時(shí)，靈敏度提高，但樣品中的高沸點(diǎn)雜質(zhì)污染分流平板及毛細(xì)管色譜柱，給氣相色譜儀的清潔和維護(hù)帶來不便；香菇中的含硫成分對(duì)氣相色譜法測(cè)定有機(jī)磷產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于無需加熱，在分析易分解農(nóng)藥時(shí)有一定優(yōu)勢(shì)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式也可以消除一些干擾，且質(zhì)譜定性是一種比較可靠的手段。因此本研究采用分散固相萃取凈化、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香菇中23種有機(jī)磷農(nóng)藥，優(yōu)化了樣品前處理和質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)，建立了香菇中多種有機(jī)磷的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮香菇和干香菇 市購；23種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；C18和N-丙基乙二胺（primarysecondary amine，PSA）粉末 美國Agilent公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Tedia公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為三重過濾去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6430A 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源） 美國Agilent公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；IKA高速分散均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；KDC-40低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；MTN-2800D氮吹儀 北京博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

鮮香菇：稱取10.00g粉碎好的樣品置于50mL離心管中，加入20mL乙腈，于10000r/min均質(zhì)1min，加入3g氯化鈉，充分振蕩，于3500r/min離心5min，吸取乙腈層10mL于玻璃管中，待凈化。

干香菇：稱取5.00g粉碎好的樣品置于50mL離心管中，加入10mL水，再加入20mL乙腈，充分振蕩，于超聲波提取儀提取30min，加入3g氯化鈉，充分振蕩，于3500r/min離心5min，吸取乙腈層10mL于玻璃管中，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

在提取液中加入0.2g C18粉末、0.3g PSA粉末、2g無水硫酸鎂，振蕩2min，于3500r/min離心5min，移取一定體積上清液（鮮香菇4 mL、干香菇8 mL）在40 ℃用氮?dú)獯抵两桑约状?水（1∶1，V/V）定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取空白香菇樣品按1.3.1節(jié)提取和1.3.2節(jié)凈化吹干后，用標(biāo)準(zhǔn)溶液代替純?nèi)軇┒ㄈ葜? mL，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：VenusilMP C18色譜柱（100mm×2.1mm，3 μm）；流動(dòng)相A為0.2%甲酸（V/V，下同）溶液，流動(dòng)相B為甲醇；流速0.2 mL/min；梯度洗脫程序：0～4min，10%～50%B；4～10min，50%～60%B；10～15min，60%～70%B；15～18min，70%～95%B；18～22min，95%～100%B；22～25min，100%B；25～25.1min，100%～10%B；25.1～30min，10%B；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10μL。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量10L/min；毛細(xì)管電壓4000V；源溫度100 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

表 1 提溶劑對(duì)鮮香菇、干香菇中23種有機(jī)磷提取率的影響（加標(biāo)0.022 mg//kkgg））TTaabbllee 1 1 EEffecctt o of fe xetxratcraticotni osonl vseonltvse onnt tsh oe nre tchoeve rreyc oof v2e3ry of 23 rgaannoopphohsopshpohruosr puess tpiceisdteisc firdoems freosmh a fnrde sdhri eadn d dried Lentinus edooddeess spiikkeedd a ta 0t.02.0 m2 gm/kgg/kg % o序號(hào) 名稱 鮮香菇 干香菇乙腈 丙酮 甲醇 乙腈 丙酮 甲醇1 甲胺磷 72.7 62.5 65.7 71.3 61.3 59.8 2 乙酰甲胺磷 73.4 63.2 66.4 78.4 68.5 61.3 3 氧化樂果 78.5 58.4 60.2 76.6 66.8 62.4 4 久效磷 80.4 70.1 73.7 78.2 68.1 71.5 5 樂果 82.5 73.5 75.0 92.5 72.3 80.1 6 敵敵畏 77.4 67.8 69.1 79.1 60.4 68.7 7 殺撲磷 83.5 73.4 76.5 76.7 64.7 71.4 8 亞胺硫磷 81.4 61.5 77.3 89.5 65.5 60.9 9 甲基對(duì)硫磷 79.9 71.1 70.2 75.7 71.2 73.0 10 馬拉硫磷 89.2 69.3 68.3 82.6 62.5 74.6 11 氯唑磷 87.8 80.2 79.4 88.7 78.4 80.2 12 水胺硫磷 76.5 71.6 68.5 79.3 72.6 72.8 13 三唑磷 94.3 82.3 86.4 92.1 77.6 72.9 14 滅線磷 75.7 72.6 70.7 81.4 71.5 77.5 15 殺螟硫磷 85.0 80.1 68.3 87.5 70.9 72.4 16 對(duì)硫磷 73.8 71.7 62.6 78.1 72.7 63.8 17 伏殺硫磷 77.5 72.9 57.4 75.8 69.8 69.3 18 甲拌磷 78.7 68.4 60.7 74.6 64.5 60.7 19 甲基毒死蜱 80.1 79.6 55.8 88.7 67.9 52.9 20 丙溴磷 102 92.1 67.3 94.6 75.8 60.3 21 乙硫磷 78.3 72.5 56.1 77.3 67.2 64.1 22 毒死蜱 88.3 78.7 61.5 84.9 69.8 77.5 23 乙拌磷 75.3 70.6 57.8 73.6 64.5 68.2

有機(jī)磷的極性不同，在不同的提取劑中的溶解度也不同。為了提取有機(jī)磷，分別用丙酮、甲醇、乙腈作為提取溶劑進(jìn)行研究，提取率見表1，發(fā)現(xiàn)乙腈的提取率最高，雜質(zhì)相對(duì)較少，選擇乙腈為提取劑。由于PSA粉末對(duì)樣品中的強(qiáng)極性雜質(zhì)，如有機(jī)酸、糖類，有良好的凈化效果，而C18去除油脂等非極性雜質(zhì)效果顯著，無水硫酸鎂可除去少量水分。因此針對(duì)香菇中的干擾成分，采用C18、PSA粉末和無水硫酸鎂進(jìn)行凈化。

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

配制1mg/L各有機(jī)磷單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化：在電噴霧正離子模式下，利用自動(dòng)優(yōu)化軟件設(shè)定各有機(jī)磷的相對(duì)分子質(zhì)量、碎裂電壓范圍、碰撞能量范圍、子離子范圍，根據(jù)最大離子豐度最終確定定量離子、定性離子、碎裂電壓及碰撞能量。其中乙拌磷用自動(dòng)優(yōu)化軟件無法得到正確的子離子，需通過手動(dòng)設(shè)定母離子，在正離子模式下掃描子離子，確定了子離子后再優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能量。優(yōu)化后的結(jié)果見表2。

注：?.定量離子。

2.3 方法的定量限、回收率、精密度和線性范圍

采用陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在0.01mg/kg加標(biāo)水平的信噪比均大于10，確定該方法的定量限為0.01mg/kg。用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試，線性范圍、相關(guān)系數(shù)和線性方程見表3。在樣品中分別添加0.01、0.02、0.05mg/kg的各有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，3水平的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）見表4。回收率為70.2%～105.0% ，RSD為3.5%～13.0%，滿足農(nóng)殘分析的要求。香菇中的含硫組分在前處理中難以完全除去，由于其極性小，在電噴霧離子源質(zhì)譜儀中的響應(yīng)值低，在反相色譜儀中的保留時(shí)間長，對(duì)極性和中等極性的有機(jī)磷無干擾；乙拌磷由于極性小，受干擾大，導(dǎo)致回收率偏低；敵敵畏由于容易揮發(fā)，在前處理中損失嚴(yán)重，導(dǎo)致回收率不高。

表 3 方法的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficien ts and limits of quantification of 23 organophosphorus pesticides limits of quantification f 23 organophosphoru pesticides序號(hào) 名稱 線性范圍/（μg/L） 線性方程 相關(guān)系數(shù)定量限/（mg/kg）1 甲胺磷 5.0～100.0 Y=139.3X＋96.87 0.9964 0.0058 2 乙酰甲胺磷 5.0～100.0 Y=189.6X＋126.5 0.9932 0.0031 3 氧化樂果 20.0～200.0 Y=19.33X＋86.94 0.9962 0.0095 4 久效磷 5.0～100.0 Y=122.5X＋446.1 0.9981 0.0056 5 樂果 5.0～100.0 Y=138.3X＋705.1 0.9993 0.0037 6 敵敵畏 5.0～100.0 Y=71.12X－104.1 0.9988 0.0071 7 殺撲磷 20.0～200.0 Y=2.380X＋1.841 0.9957 0.0100 8 亞胺硫磷 20.0～200.0 Y=12.57X＋52.85 0.9987 0.0089 9 甲基對(duì)硫磷 20.0～200.0 Y=2.110X＋1.543 0.9952 0.0100 10 馬拉硫磷 5.00～100.0 Y=153.7X－305.7 0.9939 0.0042 11 氯唑磷 20.0～200.0 Y=26.72X＋33.71 0.9994 0.0086 12 水胺硫磷 20.0～200.0 Y=2.294X＋3.697 0.9938 0.0100 13 三唑磷 20.0～200.0 Y=28.39X＋75.65 0.9991 0.0082 14 滅線磷 20.0～200.0 Y=70.98X－30.91 0.9967 0.0051 15 殺螟硫磷 20.0～200.0 Y=3.890X＋5.254 0.9984 0.0100 16 對(duì)硫磷 20.0～200.0 Y=12.4X－3.56 0.9973 0.0086 17 伏殺硫磷 20.0～200.0 Y=20.98X＋30.2 0.9991 0.0078 18 甲拌磷 20.0～200.0 Y=21.75X－1.83 0.9946 0.0073 19 甲基毒死蜱 20.0～200.0 Y=10.51X－14.32 0.9938 0.0086 20 丙溴磷 20.0～200.0 Y=7.372X＋12.15 0.9995 0.0094 21 乙硫磷 20.0～200.0 Y=56.9X＋569.1 0.9995 0.0068 22 毒死蜱 20.0～200.0 Y=44.23X＋264.8 0.9996 0.0052 23 乙拌磷 20.0～200.0 Y=2.219X＋5.568 0.9956 0.0100

表 4 鮮香菇、干香菇中23種有機(jī)磷加標(biāo)回收率和精密度（n==66）Table 4 Recoveries and RSDs of 23 organophosphorus pesticides in Table 4 Recoveries and RSDs of 23 organophoshorus pesticides i n spiked samples of fresh and dried Lentinus edodes ( siked samples of fresh and dried Lentinus edode ( n == 66)) %序號(hào) 名稱鮮香菇 干香菇0.01mg/kg 0.02mg/kg 0.05mg/kg 0.01mg/kg 0.02mg/kg 0.05mg/kg回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率RSD 1 甲胺磷 70.8 8.5 72.7 6.3 75.8 5.9 70.2 8.1 71.3 6.8 70.3 7.2 2 乙酰甲胺磷 77.9 11.0 73.4 9.0 76.9 8.6 75.3 12.0 78.4 8.3 80.4 6.5 3 氧化樂果 70.6 7.3 78.5 6.6 80.6 6.9 74.9 13.0 76.6 11.0 82.2 9.8 4 久效磷 79.8 5.4 80.4 5.8 83.4 5.1 75.0 9.0 78.2 7.0 83.5 6.7 5 樂果 88.6 6.7 82.5 6.2 85.0 5.5 90.1 7.2 92.5 6.3 90.4 6.5 6 敵敵畏 76.3 12.0 77.4 11.0 79.5 10.0 75.8 11.0 79.1 8.3 78.6 8.5 7 殺撲磷 80.1 8.1 83.5 8.6 86.3 8.1 78.0 8.9 76.7 7.8 79.3 6.8 8 亞胺硫磷 85.3 9.0 81.4 7.1 87.8 6.6 86.6 7.4 89.5 6.3 90.2 5.6 9 甲基對(duì)硫磷 75.4 12.0 79.9 9.2 80.2 7.4 77.2 11.0 75.7 9.8 76.0 7.5 10 馬拉硫磷 82.0 6.8 89.2 6.7 88.5 5.6 85.0 7.3 82.6 8.2 84.3 6.5 11 氯唑磷 88.3 5.7 87.8 5.2 89.3 5.0 86.1 4.5 88.7 4.7 90.7 4.2 12 水胺硫磷 79.2 7.0 76.5 5.0 78.4 5.7 74.3 6.2 79.3 5.4 82.5 5.8 13 三唑磷 98.6 3.5 94.3 4.5 96.2 3.8 95.0 4.0 92.1 4.3 92.9 6.5 14 滅線磷 77.4 4.3 75.7 4.9 80.3 5.3 80.3 3.8 81.4 5.2 87.4 4.4 15 殺螟硫磷 88.7 5.8 85.0 5.2 88.2 4.2 84.5 5.5 87.5 3.7 82.7 6.1 16 對(duì)硫磷 71.5 6.7 73.8 5.1 78.6 7.2 73.2 6.9 78.1 4.8 83.1 5.2 17 伏殺硫磷 70.2 8.0 77.5 6.0 76.4 5.7 73.6 7.0 75.8 6.4 79.4 7.0 18 甲拌磷 75.0 9.9 78.7 5.9 80.9 4.1 78.9 9.2 74.6 8.6 80.6 6.4 19甲基毒死蜱 81.4 9.4 80.1 7.3 85.3 6.4 80.6 8.0 88.7 7.1 82.7 6.0 20 丙溴磷 105.0 6.2 102.0 4.8 97.3 4.4 101.0 5.0 94.6 4.0 90.9 3.7 21 乙硫磷 79.6 7.6 78.3 5.9 76.4 5.0 72.0 6.2 77.3 6.7 74.5 5.4 22 毒死蜱 82.5 8.8 88.3 6.4 91.5 4.6 85.9 9.1 84.9 8.4 87.6 7.1 23 乙拌磷 72.5 8.6 75.3 7.2 77.8 6.5 74.4 8.3 73.6 7.1 78.8 6.2

圖1 各樣品離子流色譜圖Fig.1 Ion current chromatograms of different samples

2.4 實(shí)際樣品分析

對(duì)5份鮮香菇和5份干香菇樣品進(jìn)行測(cè)定，其中有1份干香菇檢出毒死蜱（0.02mg/kg），其余樣品均未檢出各種有機(jī)磷農(nóng)藥。23種有機(jī)磷標(biāo)樣、陽性樣品、空白香菇樣品、加標(biāo)樣品離子流色譜圖見圖1。

3 結(jié) 論

針對(duì)香菇中有機(jī)磷測(cè)定干擾組分多、熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的靈敏度低的難點(diǎn)，建立了23種有機(jī)磷的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法靈敏度高、快速、準(zhǔn)確，定量限達(dá)到0.01mg/kg，加標(biāo)回收率在70.2%～105.0%，能滿足香菇中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的測(cè)定。

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Determination of 23 Organophosphorus Pesticide Residues inLentinus edodesby High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIANG Da-qing, SU Ken-ming, ZHANG Ju-mei, GUO Wei-peng
(State Key Laboratory of Applied Microbiology, Ministry-Provinc e Jointly Breeding Base, South China, Guangdong Provincial Open Laboratory of Applied Microbiology, G uangdong Detection Center of Microbiology, Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectromet ry (HPLC-MS-MS) method was established for the determination of 23 organophosphorus pesticide residues inLentinus edodes. Samples were extracted with acetonitrile and separated by salting out method, and then the supernatants were purified using dispersive solid-phase extraction (C18and primary-secondary amine powder) prior to HPLC-MS-MS analysis. T he analytes were identified in positive electrospray ionization and multiple reaction-monitoring modes. The matrix-m atched external standard calibration curves were used for quantitative analysis. Under the optimal conditions, the li mit of quantitation of the method was 0.01 mg/kg. The recoveries of 23 organophosphorus pesticides in spiked real sam ples were 70.2%–105.0% with relative standard deviation of 3.5%–13.0%. The method presented is sensitive, accurate and fast and can meet the requirements for the determination of organophosphorus pesticide residues inLentinus edodes.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ; organophosphorus pesticide; residues;Lentinus edodes

TS207.3

A

1002-6630（2014）04-0159-04

10.7506/spkx1002-6630-201404033

2013-06-03

廣東省重大科技專項(xiàng)（010A080403005）

梁達(dá)清（1979—），男，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称分修r(nóng)獸殘檢測(cè)。E-mail：liangdaqing_200 5@126.com