首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院（100069）賈敏 王立清 段瑾 陳曦 盛艾娟 王美霞

北京杰華生物技術(shù)有限責(zé)任公司（100102）呂秋軍 徐靜 王寶亮 梁屹

重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液（樂(lè)復(fù)能）是由北京杰華生物技術(shù)有限責(zé)任公司自主研發(fā)成功，系采用基因穿梭法，從12種人α干擾素基因構(gòu)建雜交文庫(kù)，采用高通量篩選技術(shù)，篩選10多萬(wàn)個(gè)克隆而得到的高活性新型蛋白，由498個(gè)核苷酸編碼、166個(gè)氨基酸組成，分子量為19.3kD，已經(jīng)取得美國(guó)專利。樂(lè)復(fù)能在臨床上準(zhǔn)備開(kāi)發(fā)用于治療慢性乙型肝炎（CHB），2009年獲得SFDA新藥臨床研究批件，于2010年3月正式啟動(dòng)試驗(yàn)，2011年11月完成所有受試者的治療與隨訪觀察。

該臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)成3組，共入組24例受試者。研究性治療期：6周～7周。第1組“第1日，10μg/次，1次/日；第2～7日，停藥；第2周～第7周，10μg/次，1次/日；入組8例受試者，脫落1例”；第2組“第1～6周，10μg/次，每周3次（隔日1次）；入組6例受試者”；第3組“第1周，10μg/次，1次/日；第2～6周，20μg/次，每周3次（隔日1次）；入組10例受試者”。各劑量組給藥途徑均為肌肉注射。

近年來(lái)，隨著大量生物技術(shù)藥物的研發(fā)，免疫原性的評(píng)價(jià)成為闡明這些藥物臨床安全性和有效性的關(guān)鍵因素[1]。中和抗體的活性是免疫原性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，會(huì)中和藥物的活性，影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布，改變藥效/藥動(dòng)學(xué)，使在非臨床研究中觀察到的效應(yīng)，可能并非藥物真正的藥理和/或毒性反應(yīng)，因此在評(píng)價(jià)藥物安全性時(shí)同時(shí)考察中和抗體活性非常必要。世界衛(wèi)生組織從1983年[2][3][4]開(kāi)始推薦使用 Kawade 等人[5][6][7]創(chuàng)立的細(xì)胞病變效應(yīng)實(shí)驗(yàn)作為檢測(cè)α、β干擾素中和抗體的方法，此法目前廣泛采用。這次樂(lè)復(fù)能乙肝臨床試驗(yàn)血清樣品檢測(cè)即遵循Kawada創(chuàng)立的細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic effect）方法，即10倍減少單位（Tenfold reduction Unit， TRU）中和滴度法。

1 材料

1.1 試驗(yàn)用藥 重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液(北京四環(huán)生物制藥有限公司，規(guī)格2 0μg·m l-1，批號(hào)20090601/20100101/20110303)；重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液原液（北京杰華生物技術(shù)有限責(zé)任公司，蛋白含量1.08mg·mL-1，批號(hào)01/P101206）。

1.2 樣品 待檢樣品（樂(lè)復(fù)能臨床試驗(yàn)佑安醫(yī)院受試者43天或50天抗藥抗體陽(yáng)性血清）；陰性對(duì)照血清（本實(shí)驗(yàn)室2位志愿者的血清）。

1.3 試劑與耗材 WISH細(xì)胞（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，液氮保存）；V S V水泡性口炎病毒（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，液氮保存）；MEM培養(yǎng)基（GIBCO，Cat.No. 41500-034，2℃～8℃保存）；Penstrep（GIBCO，Cat.No. 15140-122，2℃～8℃保存）；0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO，Cat.No.25200-056，2℃～8℃保存）；FBS胎牛血清（GIBCO，Cat.No. 10099-141，-20℃保存）；NaHCO3（Sigma，Cat. No. S7795-500G）；結(jié)晶紫（崇明縣裕西試劑廠）；無(wú)水乙醇（北京化工廠）；醋酸（北京化工廠）；單條可拆酶標(biāo)板（Nunc，Cat.No.468667）；96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc，Cat.No. 163320)。

1.4 儀器 酶標(biāo)儀（VERSAmax，美國(guó)Molecular Devices）；水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào) GSY-Ⅱ）；旋渦混勻器（德國(guó)IKA，型號(hào) VG3 S25）；超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰，SW-CJ-ZFD）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠，XDS-1B）；CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO，MCO-15AC）；12道移液器（美國(guó)eppendorf，型號(hào) 30～300μl）。

2 方法與結(jié)果

2.1 第1天 細(xì)胞制備

2.1.1 將WISH細(xì)胞，用0.25%Trypsin-EDTA消化后加入完全培養(yǎng)液吹均勻，制成濃度為1.8～2.2×105個(gè)·ml-1的單細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.1ml，5% CO2，37℃，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

2.1.2 將待檢血清56℃ 30分鐘滅活（水?。?，備用。

2.2 第2天 樣品稀釋

2.2.1 待檢樣品 在稀釋板上用樣品稀釋液（含10 LU·ml-1樂(lè)復(fù)能的完全培養(yǎng)基。根據(jù)Kawade法，如果多于或者少于10倍實(shí)驗(yàn)室單位，均有可能造成最終結(jié)果的偏差；在多次預(yù)實(shí)驗(yàn)中，樂(lè)復(fù)能在本實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)室單位（LU）是2pg·ml-1。）稀釋滅活后的待檢血清用樣品，從1∶20 起始，然后依次對(duì)倍稀釋至1∶640，共6個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度的血清均含20pg·ml-1的樂(lè)復(fù)能。每稀釋度做復(fù)孔，然后將稀釋好的血清樣品加入第一天鋪有WISHⅠ細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μl。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品 取自制樂(lè)復(fù)能原液，再用完全培養(yǎng)液將樂(lè)復(fù)能稀釋至15 pg·ml-1；然后依次對(duì)倍稀釋至0.47 pg·ml-1，共6 個(gè)稀釋度，每塊細(xì)胞板中加入一組標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，每個(gè)稀釋度2孔，每孔100μl。

2.2.3 細(xì)胞對(duì)照 將陰性血清1∶20 稀釋，每塊細(xì)胞板中加入3個(gè)孔，每孔 100μl。

以上2.1至2.3操作完畢后，將細(xì)胞板置CO2孵箱（5% CO2，37℃）中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

2.3 第3天 攻毒

2.3.1 病毒液的配制 從毒種庫(kù)中取出水泡性口炎病毒（VSV，-70℃保存），加入細(xì)胞攻毒液，配成100 CCID50的病毒攻擊液備用。

2.3.2 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去板中液體并拍干，加入制備的病毒液每孔100μl，3個(gè)細(xì)胞對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)基，余加入細(xì)胞攻毒培養(yǎng)液。

2.3.3 培養(yǎng) 將細(xì)胞板置CO2孵箱（5%CO2，37℃）中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

2.4 第4天 終止

鏡檢標(biāo)準(zhǔn)品孔5 0%病變點(diǎn)約在2 pg·ml-1。然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入染色液 50μl置30分鐘后，用流水小心沖去染色液，待板晾干后每孔加入脫色液100μl，混勻后，用酶標(biāo)儀以630nm為參比波長(zhǎng)，570nm為測(cè)定波長(zhǎng)，檢測(cè)吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果。

2.5 陽(yáng)性血清樣本中和抗體活性結(jié)果

前期研究發(fā)現(xiàn)23例受試者出組時(shí)(給藥后第50天或第43天)，除1#受試者外均產(chǎn)生了抗藥抗體，但中和抗體活性結(jié)果檢出率為0%，結(jié)果如附表所示。

3 討論

干擾素抗體的發(fā)生率因干擾素種類(lèi)的不同有差異，目前認(rèn)為基因重組α干擾素的抗體出現(xiàn)率明顯高于天然α干擾素(人白細(xì)胞干擾素或人類(lèi)淋巴母細(xì)胞干擾素) ，臨床上應(yīng)用的IFN-α有IFN-α2a、IFNα2b、IFN-αl三種，一般認(rèn)為IFN-α2a產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性率及效價(jià)最高，IFN-α2b次之，IFN-α1最低，其中，INF-α2a的抗體產(chǎn)生率為20%～40%，INF-α2b的抗體產(chǎn)生率為6.9%～40%，INF-αNl為 0.97%[8][9][10]。干擾素抗體可根據(jù)是否中和干擾素的生物學(xué)活性分為兩種：一種為中和抗體(NA)，可與干擾素的生物學(xué)活性位點(diǎn)結(jié)合，中和干擾素活性，降低血清干擾素水平，從而使干擾素失去生物學(xué)活性；另一種為結(jié)合抗體(BA)，當(dāng)它與干擾素結(jié)合時(shí)，不影響干擾素的生物學(xué)活性。劉勁陽(yáng)等[11]， 陳憲銳等[12]多篇研究中均報(bào)道中和抗體的出現(xiàn)與干擾素治療失敗顯著相關(guān)，中和抗體是影響干擾素治療療效的重要因素之一。本研究中樂(lè)復(fù)能應(yīng)用于患者后，抗藥抗體產(chǎn)生率接近100%，但卻沒(méi)有中和抗體活性。初步推測(cè)樂(lè)復(fù)能中和抗體的產(chǎn)生率低于普通干擾素，需要后期臨床試驗(yàn)加大受試者例數(shù)來(lái)確證。由于干擾素臨床適應(yīng)癥廣泛，療效確切，國(guó)內(nèi)臨床需求量大，國(guó)外進(jìn)口藥品價(jià)格昂貴等諸多因素，干擾素類(lèi)新藥物的研發(fā)刻不容緩。

附表 佑安醫(yī)院受試者（抗體陽(yáng)性）血清樣本結(jié)束給藥時(shí)抗體滴度和中和抗體活性