李成義，王燕，強(qiáng)正澤，李碩

(甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

紅芪與黃芪中兩個(gè)異黃酮類成分含量的比較研究△

李成義，王燕，強(qiáng)正澤，李碩*

(甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的通過高效液相色譜法，對(duì)紅芪和黃芪藥材進(jìn)行鑒別和定量分析，為藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。方法色譜柱為TC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，TC-C18保護(hù)柱(10 mm× 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸水溶液(梯度洗脫)，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果15批紅芪樣品中芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于毛蕊異黃酮，其中芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在77.51～424.94 μg·g-1，毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.27～26.13 μg·g-1；而7批黃芪中芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于毛蕊異黃酮，其中芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4.84～29.94 μg·g-1，毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12.95～62.98 μg·g-1。結(jié)論毛蕊異黃酮和芒柄花素的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可作為紅芪與黃芪的定性鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要特征之一。

紅芪；黃芪；毛蕊異黃酮；芒柄花素；HPLC

紅芪(Hedysari Radix)與黃芪(Astragali Radix)均為甘肅主產(chǎn)特色藥材，其分別來源于豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.、蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。在中醫(yī)臨床上，紅芪與黃芪均為補(bǔ)氣要藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌的功能，多用于治療氣虛引起的各種病癥[2-3]。中藥紅芪自古與黃芪通用，臨床用藥時(shí)紅黃不分，直到1985年版《中國(guó)藥典》始將兩者分列。藥材的傳統(tǒng)鑒別雖簡(jiǎn)單易行，但其應(yīng)用范圍相對(duì)較窄，且需積累大量的鑒別經(jīng)驗(yàn)。而高效液相色譜法作為常用的一種現(xiàn)代鑒別方法，其應(yīng)用范圍較廣。通過HPLC法不僅可對(duì)紅芪和黃芪藥材進(jìn)行定性鑒別，還可對(duì)其所含指標(biāo)性成分進(jìn)行定量分析，進(jìn)而對(duì)藥材質(zhì)量作出初步判斷。

1 材料與儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用22批藥材樣品分別采自甘肅省定西市和隴南市的不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)。經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李成義教授鑒定，1～15號(hào)樣品為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，16～22號(hào)樣品為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

對(duì)照品毛蕊異黃酮(批號(hào)：MUST-13030602)和芒柄花素(批號(hào)：MUST-13050801)購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，純度均為99%；乙腈(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純)；甲醇(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，分析純)；磷酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，優(yōu)級(jí)純)；水(娃哈哈純凈水)。

1.2 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(安捷倫公司)，DAD檢測(cè)器(美國(guó))；萬(wàn)分之一AL 104型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；十萬(wàn)分之一OHAUS Corporation DV SERIES型電子天平(奧豪斯儀器有限責(zé)任公司)；DJ-02型中藥粉碎機(jī)(上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司)；HHS-4S型電熱恒溫水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)；KQ-250TDB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，TC-C18保護(hù)柱(10 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(B)-0.01%磷酸水(A)溶液，梯度洗脫(0～25 min，30%～33% B；25～45 min，33%～36% B)，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。在此色譜條件下色譜圖分離度良好(見圖1)。

A.紅芪藥材 B.黃芪藥材 C.對(duì)照品 1.毛蕊異黃酮 2.芒柄花素 圖1 紅芪、黃芪藥材及對(duì)照品HPLC圖

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品1.13 mg、4.05 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容于10 mL容量瓶中，作為貯備液A、B。分別精密吸取這兩種對(duì)照品貯備液2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成混合對(duì)照品溶液C。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取藥材樣品粉末3.000 0 g，置150 mL錐形瓶中，加入甲醇30 mL，于80 ℃水浴回流提取1 h，過濾，濾液減壓回收甲醇至一定量后再以適量甲醇定容至10 mL容量瓶中，進(jìn)樣前以0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液[4]。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取一定量的混合對(duì)照品溶液，將其制成8個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液，其中毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度為0.226，0.452，2.260，11.300，22.600，33.900，45.200，61.020 μg·mL-1，芒柄花素質(zhì)量濃度為0.810，1.620，8.100，40.500，81.000，121.500，162.000，218.700 μg·mL-1，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定。以質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及其線性范圍，見表1。

表1 毛蕊異黃酮、芒柄花素成分的線性回歸方程

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2.1項(xiàng)下所制毛蕊異黃酮和芒柄花素的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，其峰面積積分值的RSD值分別為0.05%、0.04%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批紅芪藥材的供試品溶液(編號(hào)：2013-SY-03)，于室溫下放置，分別于0，4，8，12，20，24 h 進(jìn)樣檢測(cè)，按2種異黃酮類成分的峰面積積分值分別計(jì)算其RSD值。結(jié)果該樣品中毛蕊異黃酮、芒柄花素的RSD值分別為2.65%、0.72%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批紅芪藥材粉末(編號(hào)：2013-SY-03)，精密稱取樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定。結(jié)果該樣品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的RSD值分別為1.50%、0.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的紅芪樣品(編號(hào)：2013-SY-03)9份，每份約1.0 g，精密加入一定量的毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品，其加入量分別為該樣品中相應(yīng)成分含量的80%(10.17，222.75 μg)、100%(14.69，263.25 μg)、120%(18.08，303.75 μg)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果毛蕊異黃酮和芒柄花素回收率的RSD值分別為2.76%、2.52%。

2.8 紅芪與黃芪樣品中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量測(cè)定

22批樣品的供試品溶液均按2.2.2項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下所述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別記錄毛蕊異黃酮和芒柄花素相應(yīng)色譜峰的峰面積，然后將色譜峰峰面積代入相應(yīng)的回歸方程，計(jì)算紅芪與黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 紅芪、黃芪藥材中毛蕊異黃酮、芒柄花素的測(cè)定

2.9 紅芪中毛蕊異黃酮與芒柄花素含量的線性關(guān)系分析[6]

毛蕊異黃酮與芒柄花素為紅芪藥材中兩個(gè)主要的異黃酮類成分，通過SPSS 17.0軟件對(duì)15批樣本的相關(guān)系數(shù)(r=0.663)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.01，說明紅芪藥材中毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在線性關(guān)系。在線性擬合時(shí)以毛蕊異黃酮為自變量，芒柄花素為因變量，應(yīng)用最小二乘法可得表2中所有紅芪樣品數(shù)據(jù)的擬合圖(見圖2)及一元線性回歸方程：Y=48.412+9.478X。通過對(duì)該回歸方程的F檢驗(yàn)，P<0.01，說明此回歸方程有意義。

圖2 紅芪中毛蕊異黃酮與芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)系擬合圖

3 討論

從表2可以看出15批紅芪樣品中芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于毛蕊異黃酮，其中芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在77.51～424.94 μg·g-1，毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.27～26.13 μg·g-1；而7批黃芪中芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于毛蕊異黃酮，其中芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4.84～29.94 μg·g-1，毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12.95～62.98 μg·g-1。此特點(diǎn)可作為紅芪與黃芪鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要特征之一。

通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，表明本實(shí)驗(yàn)所采用的測(cè)定紅芪與黃芪藥材中2個(gè)化合物含量的鑒別方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確，且具有一定的實(shí)用性，可用于紅芪與黃芪的定性定量鑒別。

通過對(duì)樣本紅芪中毛蕊異黃酮與芒柄花素含量的線性關(guān)系分析，證明紅芪中毛蕊異黃酮含量與芒柄花素含量之間存在線性關(guān)系。該線性關(guān)系的建立可在僅知道某一種成分含量的情況下對(duì)另一種成分的含量進(jìn)行初步估算。

毛蕊異黃酮和芒柄花素為紅芪與黃芪藥材中的指標(biāo)成分，均具有抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、防止骨質(zhì)疏松及神經(jīng)保護(hù)等作用。近年來，有學(xué)者對(duì)紅芪和黃芪中兩個(gè)異黃酮類成分與藥效的相關(guān)性及兩成分藥效間的差異性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)芒柄花素是廣泛存在于自然界的一種具有類雌二醇分子結(jié)構(gòu)的化合物，具有弱雌激素樣作用，可促進(jìn)乳腺發(fā)育，保護(hù)心血管系統(tǒng)，改善血脂紊亂，降低總膽固醇，抑制腸平滑肌收縮及促進(jìn)傷口愈合等作用[6-8]；

毛蕊異黃酮具有防止腎臟纖維化[9]和保護(hù)腦細(xì)胞[10]等作用；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞能力和抗氧化能力強(qiáng)于芒柄花素[11-12]。但目前有關(guān)中藥紅芪與黃芪中芒柄花素和毛蕊異黃酮的藥效與藥材質(zhì)量相關(guān)性研究的報(bào)道尚不多見，有待進(jìn)一步研究。

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ComparativeStudyofFormononetinandCalycosinContentinHedysariRadixandAstragaliRadix

LIChengyi，WANGYan，QIANGZhengze，LIShuo*

(GansuCollegeofTraditionalChineseMedicine，Lanzhou730000,China)

Objective：To do identification and qualitative analysis on Hedysari Radix and Astragali Radix by HPLC，and provide a scientific basis for the quality evaluation.MethodsThe sample was separated on TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)column.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.01%phosphoric acid solution(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The UV detection wave length was set at 248 nm.The column temperature was set at 30 ℃.The injection volume was 10 μL.ResultsFormononetin content was higher than calycosin in Hedysari Radix.Formononetin content was between 77.51～424.94 μg·g-1，and calycosin between 2.27～26.13 μg·g-1，but the contents in Astragali Radix were exactly opposite.Formononetin content was between 4.84～29.94 μg·g-1，and calycosin between 12.95～62.98 μg·g-1.ConclusionThe relative content of formononetin and calycosin can be main features of qualitative identification and quality evaluation on Hedysari Radix and Astragali Radix.

Hedysari Radix；Astragali Radix；Calycosin；Formononetin；HPLC

國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)資助項(xiàng)目(地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目)——甘肅地產(chǎn)藥材紅芪道地性與生態(tài)因子的相關(guān)性研究(81360621)

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李碩，講師，研究方向：中藥品種與質(zhì)量研究；Tel：(0931)8765385，E-mail：29068323@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.004

2014-05-04)